簡述逆轉錄PCR的延伸時間原因
用PCR儀擴增時,變性-退火-延伸循環完成后,繼續72度延伸了10分鐘的原因:
1、延伸時間取決于待擴增DNA片段的長度,當然是在反應體系一定的條件下。例如,使用TaqDNA聚合酶,72度時的堿基摻入率為35-100bp/s,因此延伸速率為1kb/min。
2、根據延伸速率推得,擴增1kb以內的DNA片段1min即可,而3-4kb則需要3-4min,依次照推。通常在最后一輪要適當的將延伸時間延長至4-10min,這樣做是使PCR反應完全以提高擴增產量。
3、繼續72度延伸了10分鐘除了可以使PCR反應完全以提高擴增產量外,還有一個作用是:在用普通Taq酶進行PCR擴增時在產物末端加A尾的作用,可以直接用于TA克隆的進行。
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