Orbitrap的過去、現在和未來
——訪Orbitrap發明人Alexander Makarov
【導語】Orbitrap無疑是近20年來質譜技術上最重要的發明，不僅使賽默飛在這個質量分析器上花樣翻新、喜獲豐收，也給無數的質譜用戶帶來超乎尋常的極致體驗。在重慶舉辦的第八屆中國蛋白質組學大會上，我們有幸采訪到Orbitrap的發明人、賽默飛色譜質譜部生命科學質譜研發總監Alexander Makarov，以及賽默飛色譜質譜部負責全球銷售的副總裁Herb Kenny，色譜質譜部生命科學質譜的總經理John F. Sos，他們為我們分享了Orbitrap誕生的很多故事，并展望了Orbitrap的未來，希望對所有的質譜愛好者有幫助，激勵更多的科學家們為我們帶來更多的發明……
Orbitrap的發明人Alexander Makarov
Orbitrap是如何誕生的
邁入質譜門
亞力山大 馬可洛夫（Alexander Makarov）1966年出生在俄羅斯Irkutsk的Siberian鎮。回顧自己的經歷，Makarov說：“我小時候就喜歡發明，并不是喜歡發現大自然界的奧秘，而是喜歡發明世界上還沒有的東西。小時候我就發明了一些東西，比如不同的機械，不過可沒什么ZL，現在，這些機械已經被真正的發明并應用。雖然小時候的發明并不是很‘成功’，但這是我開始發明的起步。”
大學期間Makarov就顯示了驚人的發明才能。他1983-1989年在莫斯科工程物理學院（MEPhI）讀大學，88-89年在分子物理系做研究助手，就發明設計了超對數場（hyper-logarithmic field）的多電極飛行時間質量分析器用于火花離子源（spark ion source），并提供了原理的證明，那時候Makarov只有23歲，同時他直接獲得了科學碩士的學位獎勵。隨后89-92年Makarov從師于MEPhI 的A.A.Sysoev教授，完成了物理和數學的博士學位，論文題目是：靜態電磁場帶電粒子的 準同步運動（Quasi-isochronous motion of charged particles in static electromagnetic fields）。
談到如何邁入質譜的大門，Makarov說：“我開始從事質譜工作是一個偶然。MEphI主要研究的是核工業，當時也只有這家大學提供質譜的課程。那時的我對真正的科學抱有很羅曼蒂克的想法，渴望快速做出一些引人注目的工作。大學第二年在分子物理系學習時，我開始思考，周圍的人們在做什么樣的項目，但是沒有人特別注意我。除了Sysoev教授，他開始讓我學習質譜，我在那里完成了質譜的學習，這種偶然，僅僅是因為別的教授太忙，沒有注意我急切的渴求。”
做一個理想的質量分析器：從FTICR到TOF，和23歲的發明
Makarov接下來談到了發明Orbitrap一直以來的動力，“完成大學課程做研究助手時，我常常撞見一個面目猙獰的研究生，他有天告訴我：‘如果你真的想干點兒有用的事兒，就為我的火花離子源開發一個理想的質量分析器！’這就是我為什么一直努力在做質量分析器，直到現在還在做的真正原因。那時的我并不太了解什么是質量分析器、什么是火花離子源，所以我就開始學習更多知識，學習質譜分析器和離子源。”
鼓勵Makarov發明質量分析器的研究生A.Pekaln，以及綜述“理想的質量分析器：事實還是虛構”中提到的當時的6種質量分析器：四極桿、三重四極桿、離子阱、磁質譜、TOF、FT-ICR
當時他被一篇1987年的綜述深深鼓舞。綜述的題目是：The ideal mass analyzer: fact or fiction（理想的質量分析器：事實還是虛構），作者單位是不萊梅的Finnigan MAT公司。綜述中強調，“理想的質量分析器”的挑戰是真實存在的。結果多年后Makarov來到了作者單位的這家公司并工作至今。（注：賽默飛公司質譜部門的一個重要工廠在德國布萊梅，以前叫做Finnigan MAT）。
綜述中列出了那時的6種質量分析器，磁質譜、四極桿、三重四極桿、離子阱、FTICR，TOF，并形象地把它們畫作6個孤島，島與島之間是分離的，因為每種質量分析器有如此不同的分析參數。那么，哪一個島是可能幫助他發明那個“理想的質量分析器”呢？
首先，Makarov先被FT-ICR吸引，它的性能超出所有其它的分析器，分辨率、質量準確度、靈敏度，各項性能都接近“理想”。不過有個重大的缺陷導致其“很不理想”，需使用巨大的磁場。“當時我可沒過多學習磁場的知識，不太理解也不喜歡巨大磁場這種方式，這可不是我的菜。”Makarov說。
有次他發問：“捕獲這些離子，我們能不用磁場、只用靜電場么？”得到一干眾人的回答是：“?*?!%，你不知道離子不能在靜電場中休息（rest）么？”
這條反問絕對正確！物理學中有條恩紹定理(Earnshaw's theorem)：
點電荷的集合不能被穩定維持在僅由電荷的靜電相互作用構成的一個穩定靜止的力學平衡結構中。
這是真的，不久后他意識到這句話的關鍵詞，如果移去 “靜止的”這個關鍵詞，而是讓離子動起來，那么離子就可能穩定。
因此，Makarov把目光從FT ICR投向其它的質量分析器。不久后，他發現了上述反問和定理的關鍵限制因素是：“休息（rest）”和“靜止不動（stationary）”。離子必須動起來，而不是停在那兒，然后他們就可能在靜電場中變得穩定！這就像我們的太陽系保持穩定，或是人造地球衛星環繞地球穩定運動一樣。事實上，這個想法很早就在一個叫Kingdon的阱中實現了，被用于光譜，但很難變成質譜的裝置。因為它拒絕所有從外部進入Kingdon阱中的離子，內部也無法放置任何檢測器；即使前兩項沒問題，質量分離的能力也非常弱。“因此后來我有很多年都沒再研究Kingdon阱。”
說明：Orbitrap脫胎于由通用電氣公司的K. Kingdon于1923年發明的一個稱為Kingdon trap的離子捕集裝置。Orbital device這個裝置不使用任何磁場或高頻電場，僅使用靜電場捕集離子。用于捕集離子的靜電場是由一個作為外電極的金屬圓筒和一條作為中心電極的細銅線構成。在兩個電極之間施以直流電壓，即可建立一個以中心電極為軸心的非線性對數電場。離子可沿軸線運動、可以穩定，不會撞壁，但卻無法沿軸向引出。
接下來，Makarov專注于開發一種具有理想時間聚焦能力的TOF，在博士論文中，他發展了理想的TOF聚焦理論，并成功地搭建了使用這種“quadro-logarithmic”四極對數場的裝置；發明了帶軸向反射的旋轉TOF鏡，并參與設計了裝配大面積塵埃效應離子源的TOFMS，用于分析行星際的微小隕石。“我摸索著、跌跌撞撞地研究出一種合適的電場，后來再次成為orbitrap的基礎。這種電場被環形電極約束。我喜歡這種電場，因為它在特定方向上提供了很好的TOF聚焦，這個技術被用在了開始那個研究生讓我設計的火花離子源TOF上。這種TOF能夠得到相對高的分辨率，Gall L.N., Golikov Y.K., Aleksandrov M.L., Pechalina Y.E., Holin N.A. SU Pat. 1247973, 1989. 當時，我的母親說我發明了一個‘捕蚊器（mosquito-catcher）’。后來我還做了許多類似的‘捕蚊器’，還在被人們使用。”
Orbitrap：做一個全新質量分析器，綜合FTICR、TOF和離子阱的優點
隨著前蘇聯解體，國家陷入混亂，期間Makarov卻正癡迷于研發各種TOF，并發明了多種理論和儀器（詳見本文附錄），如：Dust impact TOF、REMPI-TOF、MALDI-磁扇/TOF、MALDI –TOF/TOF等。1996年，Makarov加入曼徹斯特的小質譜公司HD Technologies，加入時是該公司的第4個員工，直到2000年該公司被ThermoFinnigan（現在的賽默飛）收購。公司的創建者是Steve Davis，他告訴Makarov說：
“對我們這個小公司，如果要成功，我們需要在車庫中創建全新的技術。它最好同時具有FT ICR的分辨率、有線性TOF的靈敏度、有四極離子阱的小體積和各種性能。”
這真是一個挑戰。
由于電磁扇形和四極桿質量分析器都是連續接受離子，其它幾種都是脈沖接受離子的，所以不再考慮這兩種；而需要綜合FTICR、離子阱、TOF的優點，采用一些技術來消除它們的缺點。
| |
FTCIR | 離子阱 | TOF |
| 分辨能力 | 優秀 | 中等 | 中上等 |
| 離子傳輸效率 | 中等 | 優秀 | 差 |
| 質量準確度 | 優秀 | 差 | 優秀 |
| 動態范圍 | 優秀 | 優秀 | 優秀 |
| 速度 | 中等 | 優秀 | 優秀 |
| 定量 | 優秀 | 中等 | 中等 |
| 所有離子的檢測 | 優秀 | 優秀 | 優秀 |
| 使用簡單性 | 差 | 優秀 | 中等 |
| 擬消除缺點的方式 | 鏡像電流檢測 | 提高離子捕獲能力，使用修改形狀的電極 | 脈沖進樣，靜電場 |
這時Makarov又想起了Kingdon阱，當時的困難是：它拒絕所有從外部進入Kingdon阱中的離子，內部也無法放置任何檢測器；即使前兩項沒問題，質量分離的能力也非常弱。然而，當同樣的原理被用于經過改良的電極結構后，它幾乎變成了一個理想的Kingdon阱。被稱為理想是因為軸向的振蕩行為很像諧波振蕩器：軸向頻率ωz不依賴于離子的動能和位置。因此，可僅將軸向頻率用于質量分析。“理想的King阱”具有Quadro-logarithmic電場，成為了Orbitrap質量分析器。其中，改良的電極結構為：將內外電極都改為紡錘形，在外電極上開口。
Orbitrap電場勢能場特性
離子軸向轉動頻率ωz不依賴于離子的動能和位置，直接與質荷比有關
用鏡像電流可檢測離子。在Orbitrap中，不同m/z有不同的軸向諧振頻率，在裂口的外電極上可感應出鏡像電流；多個離子產生一個疊加的復雜頻域信號，用傅里葉變換技術可以測定頻率，計算出其m/z，這非常像FTICR。
那么如何捕獲離子？離子在Orbitrap中有三個方向的運動，只有軸向轉動僅與m/z有關，那么激發離子開始運動后，就可以在外電極感應檢測。這樣排除了阱內部的影響，所有離子都被檢測，將噪音水平降到極低，可獲得高靈敏度。
解決了離子捕獲和檢測的問題后，如何使離子從外部進入Orbitrap？
首先，可以把同一m/z的離子做成一個窄包（short packet）；然后提高電壓壓縮離子；進行“注入激發（Excitation by injection）”初始化；使電壓和離子軌道穩定；離子就會呈角擴散形式的旋轉環沿軸來回諧振。
公司缺乏資金，Makarov用英國政府提供的有限的SMART基金，購買了一些實驗器件就開始工作了。這套使用激光源的裝置大部分由Makarov本人搭建，同事Robert Lawther做工程化部分，Andy Hoffmann做電子學部分，Steve Davis博士做科學部分。Makarov終于做出了證實原理的帶激光離子源的Orbitrap質量分析器，1998年10月采集到了第一張譜圖，1999年年中提高裝置的分辨率至150,000，該結果首次在1999年ASMS（Dallas, TX）上被報道。
2000年，ThermoFinnigan收購了HD Tech.公司，并入其在英國的MassLab子公司，但收購的主要原因不是為了Orbitrap，而是HD Tech.公司擁有的TOF技術。隨后到2002年，該公司決定關掉英國的MassLab公司全部搬至德國的不萊梅，很多原TOF技術團隊的員工都不愿到德國，結果TOF項目最終停止了，比如賽默飛后來停產了Tempus GC-TOF。
“Orbitrap項目后來得以生存并發揚光大，這里僥幸地是因為Orbitrap團隊的3個核心成員都到了不萊梅；而原TOF團隊的核心成員都不愿意去不萊梅。”Makarov談到此處非常感慨：“所以我們有一個重要的經驗教訓，在高科技研發領域，人是最重要的，而不是技術本身。當你只是做生產，這是相對簡單的；而如果你是開始一項新技術，所需的知識和動力都來源于人，新技術沒有人是無法自己開始的。”
Orbitrap的商品化道路
對原理的證實是非常棒的，但仍無法保證orbitrap能夠被成功地開發為商品化儀器。
Makarov回顧說：“1999年后，Orbitrap至少還有12個遺留的難點問題。第一個就是，現有的Orbitrap用脈沖源，無法提供一個滿足要求的時空參數的離子包，用于連續離子源。僅這一點就很致命，因為Thermo那時的離子源全是連續流的，而我們的公司剛被Thermo買了。克服這12個難點還有很長的路要走。”
“發明orbitrap分析器只是第一步，后來還有7-8次路線變化（turns）。每一次路線變化時，我們都必須舍棄原來的想法，開始一個新的，因為那些想法后來運行得不好。我們必須根據環境和情況不斷調整，從而使orbitrap可以克服各種困難繼續下去。
我不知道項目是否可以永久進行下去，從沒有人承諾過我。不過每一次我們都不僅僅采用一條路線，而是在此研究中并行探索幾條路線，從而以防萬一，這樣一條路實在走不通時，我們可以跳到第二條路上。這意味著你從來不應該把自己局限在一個想法上，而應該想20種可能，正是這20種可能后來挽救了orbitrap。因為每一次開始最顯而易見的道路、最清晰的道路，往往被證明是錯誤的，我們需要跳轉到另一條路上。比如C-trap、分析器、orbitrap的生產等等。這種‘在盒子之外思考、及時跳出’的能力，對于orbitrap的成功至關重要。”
在英國MassLab時，項目組集中精力開發Orbitrap同連續源（而不是脈沖源）的接口。Mark Hardman參與了全部的工作。2001年，項目組得到了使用外部RF-only存儲器（后被稱作C-Trap）、積累大量離子、然后快速注入orbitrap分析器的第一組數據。C-trap解決了離子引入orbitrap的關鍵問題，C-trap可以存儲積累離子，并且可以將orbitrap跟外界徹底去耦合，因此將可以和任何的離子化手段或碎裂方式相連。進一步的研究中，項目組加入了更多至關重要的人，如電子工程師Alexander Kholomeev，Eduard Denisov博士，項目組開始集中精力研究離子光學、并進行orbitrap技術平臺的機械和物理設計。
項目組后來面臨真空、供電、檢測系統等更多的嚴峻挑戰。賽默飛于2002年7月決定關閉曼徹斯特工廠，將Orbitrap的研發項目組搬遷到德國布萊梅，讓全公司的質譜研發資源可以更好地支持Orbitrap項目。而Masslab項目組集全力搭建的那臺儀器于2003年1月被搬到了美國普渡大學Graham Cooks教授實驗室，該系統繼續運轉至今。
在德國不萊梅，Orbitrap項目組有了一個更好的家。軸向存儲的限制、產率挑戰、電子和真空技術的缺點，團隊不斷面臨一個個威脅和挑戰，最終他們都發明了新型解決方案，攻克了難題。項目攻關期，更多不可或缺的天才加入團隊，包括：項目經理Stevan Homing博士，機械工程師Wilko Balschun，儀器軟件工程師Oliver Lange，電子工程師Frank Czemper和 Oliver Hengelbrock，科學家Gerhard Jung博士和Kerstin Strupat博士，測試工程師Wilfried Huels等等。
2005年，賽默飛在San Antonio的ASMS大會上推出了商品化的LTQ Orbitrap，它將LTQ和Orbitrap組合使用，充分利用LTQ線性離子阱實現離子分離、裂解和多級質譜MSn功能，LTQ分離后的離子經過反射曲線多極的C-trap，再到達Orbitrap，可進行高分辨率、高質量準確度的分析；Orbitrap是20余年來出現的一種全新的質量分析器。隨后LTQ Orbitrap獲得2006年Pittcon金獎，2006年R&D 100創新獎。Makarov本人于2007年獲得默克獎（Heinrich-Emanuel Merck Award）、2007年俄羅斯質譜學會金獎、2008年美國質譜學會的杰出貢獻獎。迄今，Orbitrap已經在全球售出幾千臺。
從2005-2013年的8年來，Orbitrap幾乎年年有新產品、新技術推出。下圖時間軸左側是新技術，右側是商品化的里程碑。幾項突破性的技術分別為：僅使用Orbitrap單分析器的Exactive，串聯四極桿的Q-Exactive，ETD/ECD/HCD多種裂解技術，雙壓阱、S-lens，高場Orbitrap，增強的傅里葉變換性能，三合一的Orbitrap Fusion。
當小編問Makarov，他的夢想是否實現時，他回答說：“還沒有。多年前當我完成博士學業時，我發現質譜研究和生命系統有關，這是我第一次意識到自己有機會從事一種研究，有可能挽救人們的生命，這是鼓舞我繼續從事質譜事業的原因。現在Orbitrap雖然已經獲得成功，但我的夢想是Orbitrap能用于每一家醫院做臨床診斷，能夠幫助改善人們的健康。如果這個夢想實現，我會非常高興。不過，還有很長的一段路要走。質譜技術才剛剛進入臨床分析，對Orbitrap來說，進入臨床要比簡單的質譜來得更晚些。因此，在我們面前還有很多年的工作要繼續。”
400-6699-117 轉 8525
