血清免疫球蛋白的提取分離、純化及鑒定-4
V 蛋白質含量測定
一、雙縮脲法測定蛋白質濃度
（一）目的
了解并掌握雙縮脈法測定蛋白質濃度的原理和方法。
（二）原理
具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應，在堿性溶液中蛋白質與硫酸銅形成紫色絡合物，在 540nm 處有最大吸收。在一定濃度的范圍內，蛋白質濃度與雙縮脲反應所呈的顏色深淺成正比，可用比色法定量測定。雙縮脲法最常用于需要快速但不要求十分精確的測定。
（三）實驗儀器
容量瓶、試管、吸管、分光光度計等。
（四）實驗試劑
1.標準蛋白溶液（5mg/ml） 準確稱取已定氮的酪蛋白（干酪素或牛血清白蛋白）用0.05mol/l 氫氧化鈉溶液配制，冰箱存放備用。
2.雙縮脲試劑：溶解1.5g 五水硫酸銅 和酒石酸鉀鈉于500ml 蒸餾水中，在攪拌下加入300ml10%氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1000ml，貯存于內壁涂以石蠟的瓶內，此試劑可長期保存。
3.樣品血清：動物血清用水稀釋10 倍，置于冰箱保存備用。
（五）操作
1．標準曲線的繪制：將7 只干燥試管編號，按下表加人試劑：
各管混勻后，分別加入雙縮脲試劑3.0ml 充分混勻，于37℃水浴30min，在波長540nm處比色，以0 號管調零點測定各管吸光度，以吸光度為縱坐標，蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線。
2. 樣品測定 取未知濃度的蛋白質溶液3.0ml，置試管內，加入雙縮脲試劑3.0ml充分混勻，在540nm 處測吸光度，對照標準曲線，求得未知溶液的蛋白質濃度（含量），在根據樣品稀釋倍數換算為g/100ml。
操作1、2 應同時進行。此外還可用標準管法測定（可參見相關資料）
二、福林-酚試劑法測定蛋白質濃度
（一）目的
熟悉并掌握福林-酚法測定蛋白質濃度的原理和方法。
（二）原理
蛋白質（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能與Folin-酚試劑起氧化還原反應，生成藍色化合物，藍色的深淺與蛋白質濃度成正比，可用比色法測定蛋白質濃度。
此法也適用于酪氨酸或色氨酸的定量測定。
（三）實驗器材
1.蛋白質及其水解產物。
2.722 型（或7220 型）分光光度計。
3.試管1.5cmx1.5cm (×8）。
4.吸管0.50ml、 0.10ml、0.20ml、5.0 ml。
（四）實驗試劑
1.福林-酚試劑A ：將19 Na2CO3 溶于50ml0.lmol/lNaOH 溶液。另將0.5gCuSO4·5H2O溶于100mll％酒石酸鉀（或酒石酸鈉）溶液。將前者50ml 與硫酸銅-酒石酸鉀溶液lml 混合。混合后的溶液一日內有效。
2.Folin-酚試劑B ：將100g 鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）、25g 鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O ）、700ml
蒸餾水、50ml 85％磷酸及100ml 濃鹽酸置于1500ml 磨口圓底燒瓶中，充分混勻后，接上磨口冷凝管，回流10h
。再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50ml
及液溴數滴，開口煮沸15min，驅除過量的溴（在通風櫥內進行）。冷卻，稀釋至1000ml，過濾，濾液呈微綠色，貯于棕色瓶中。臨用前，用標準氫氧化鈉溶液滴定，用酚酞作指示劑（由于試劑微綠，影響滴定終點的觀察，可將試劑稀釋100
倍再滴定）。根據滴定結果，將試劑稀釋至相當于1mol/l 的酸（稀釋1 倍左右），貯于冰箱中可長期保存。
3.卵清蛋白溶液：約1g 卵清蛋白溶于100 ml0.9%NaCI 溶液，離心，取上清液，用克氏定氮法測定其蛋白質含量。根據測定結果，用0.9
% NaCI 溶液稀釋卵清蛋白溶液，使其蛋白質含量為2mg/l ，亦可用2mg/m1
的牛血清白蛋白溶液。將卵清蛋白溶液準確稀釋至500ug/l。
（五）、操作
1.標準曲線的繪制
將7 支干凈試管編號，按下表順序加人試劑。混勻，室溫放置10min，各管再加Folin-
酚試劑B 0.5ml，30min 后比色(500nm)，做吸光度-蛋白質濃度曲線。
Folin-酚法測定蛋白質濃度—標準曲線的繪制
2.樣液測定
準確吸取樣液0.5ml 置干凈試管內，加入4mlFolin-酚試劑A , 10min 后，再加試劑B 0.5ml , 30min 后比色，對照標準曲線求出樣液蛋白質濃度。
三、紫外光吸收法測定蛋白質濃度
（一）目的
1．了解紫外吸收法測定蛋白質濃度的原理。
2．熟悉紫外分光光度計的使用。
（二）原理
蛋白質組成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nln 波長處有最大吸收峰，一定濃度范圍內其濃度與吸光度成正比，故可用紫外分光光度計通過比色來測定蛋白質的含量。
由于核酸在280nm 波長處也有光吸收，對蛋白質測定有一定的干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260 處。如同時測定260nm
的光吸收，通過計算可以消除其對蛋白質測定的影響。因此如溶液中存在核酸時必須同時測定280nm 及260nm
的吸光度，方可通過計算測得溶液中的蛋白質濃度。
（三）實驗器材
1 . UV-9100 型紫外可見分光光度計
2 ．容量瓶50ml
3 ．試管
4 ．吸管0.50ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml
（四）實驗試劑
1．卵清蛋白標準液：準確配制1mg/1 卵清蛋白溶液。
2．未知濃度蛋白質溶液 ：用酪蛋白配制，濃度控制在1.0 -2.5ml/l 范圍內。
3. 0.9%NaCI。
