微生物限度檢查法方法介紹
對于口服藥及外用藥,不必要求達到無菌狀態,但要保證藥物的衛生質量。這就要求進行微生物限度檢查。微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查。控制菌檢查指大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的檢查。
微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下、局部潔凈度100級的單向流空氣區城內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作,防止再污染。單向流空氣區域工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室(區)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證。
(一)檢查前的準備工作
1.培養基的制備? 微生物限度檢查所用的培養基很多,如營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、酵母浸出粉葡萄糖瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基等,其配方和配制過程均需按《中國藥典》規定的配方制備或者使用按該處方生產的符合規定的脫水培養基。配制后,應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。
2.菌液的制備
(1)菌種:驗證試驗所用的菌株傳代次數不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代),并采用適宜的菌種保藏技術,以保證試驗菌株的生物學特性用作陽性對照的菌種有:大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌(SapHylococcus aureus)[CMCC (B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )[CMCC(B)63501]、白念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus nige)[CMCC(F)98003]、乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphiB)[CMCC(B)50094]生孢梭菌(Clastridium sporogenes)[CMCC (B)64941]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]。
(2)菌液制備:接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中;生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中,培養18~24時;接種白念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中,培養24~48小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50-100CFU的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中,培養5～7天,加入3~5ml含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,吸出孢子懸液(用管口帶有薄的無菌棉花或紗布、能過濾菌絲的無菌毛細吸管)至無菌試管內,用含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數50-100CFU的孢子懸液。
3、稀釋液的制備
(1)pH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液:取磷酸二氫3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g、加水1000ml,微溫溶解,濾清,分裝,滅菌。
(2)pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液:按《中國藥典》附錄配制。
如需要,可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。
(3)09%無菌氯化鈉溶液:取氯化鈉9.0g,加水溶解使成1000ml,過濾,分裝,滅菌然后過濾,分裝,滅菌。
稀釋液配制后,應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。
(二)方法驗證試驗
當建立藥品的微生物限度檢查法時,應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法和控制菌檢查方法的驗證,以確認所采用的方法適于該藥品的細菌霉菌及酵母菌數的測定和控制菌的檢查。若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,計數方法應重新驗證。供試品檢查時,如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑,應證明其有效性驗證及對微生物的生長和存活無影響。
驗證時,規定按供試液的制備和細菌、霉菌及酵母菌計數及控制菌檢查法所規定的方法及要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。依各品種項下微生物限度標準中檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株,驗證大腸菌群檢查法時,應采用大腸埃希菌作為驗證菌株。
驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗,并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。驗證試驗也可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數和控制菌檢查同時進行。
1.細菌、霉菌及酵母計數方法的驗證
(1)試驗組:平皿法計數時,取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50-100CFU試驗菌,分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時,取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液,過濾沖洗,在最后一次的沖洗液中加入50-100CFU試驗菌,過濾,按薄膜過濾法測定其菌數。
(2)菌液組:測定所加的試驗菌數。
(3)供試品對照組:取規定量供試液,按菌落計數方法測定供試品本底菌數。
(4)稀釋劑對照組:若供試液制備需要分散、乳化中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時,應增加稀釋劑對照組,以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時,可用相應的稀釋液替代供試品,加入試驗菌,使最終菌濃度為每1ml供試液含50-100CFU,按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。
(5)結果判定:在3次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌回收率(稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率)應均不低于70%。
若試驗組的菌回收率(試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率)均不低于70%,照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數;若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%,應采用培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證。
2.控制菌檢查方法的驗證
(1)試驗組:取規定量供試液及10-100CFU試驗菌加增菌基中應控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時,取規定量供試液,過濾,沖洗,試驗菌應加在最后一次沖洗液中,過濾后,注入增菌培養基或取出濾膜接入增菌培養基中。
(2)陰性菌對照組:設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組,驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌;驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌,梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。
(3)結果判定:陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌,按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查;若試驗組未檢出試驗菌,應采用培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證。
(三)供試品的檢查
1.檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品(g、ml或cm2)。除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g或10ml:化學膜劑為100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗應增加20g或20ml(其中10g用于陽性對照試驗)檢驗時,應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品,膜劑還不得少于4片。一般應隨機抽取不少于檢驗用量(兩個以上最小包裝單位)的3倍量供試品。
2.供試液的制備根據供試品的理化特性與生物學特性,可采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需用水浴加溫時,溫度不應超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1小時。
除另有規定外,常用的供試液制備方法如下。
(1)液體供試品:取供試品10ml,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白緩沖液至100ml,混勻,作為1:10的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。
(2)固體、半固體或黏稠液供試品:取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白緩沖液至100ml,混勻,作為1:10的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80,并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。
3.檢查方法
(1)細菌、霉菌及酵母菌檢查:檢查方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時,按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數的測定。取按驗證的方法制備的均勻供試液,用pH70無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1:10、1:100、1:1000等稀釋級。
1)平皿法:采用平皿法進行菌數測定時,應取適宜的連續2～3個稀釋級的供試液。取供試液1ml,置直徑90mm的無菌平皿中注入15～20ml溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基,混勻,凝固,倒置培養。每稀釋級每種培養基至少制備2個平板。
陰性對照試驗?? 取試驗用的稀釋液1ml,置無菌平皿中,注入培養基,凝固,倒置培養。每種計數的培養基各制備2個平板,均不得有菌生長。
培養和計數 ??除另有規定外,細菌培養3天,逐日點計菌落數,一般以3天的菌落數報告;霉菌、酵母菌培養5天,逐日點計函落數,一般以5天的菌落數報告;必要時,可適當延長培養時間至7天進行菌落計數并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數點計菌落數后,計算各稀釋級供試液的平均菌落數,按菌數報告規則報告菌數。若同釋級兩個平板的菌落平均數不小于15,則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。
一般營養瓊脂培養基用于細菌計數;玫瑰紅鈉瓊脂培養基用于霉菌及酵母菌計數酵母浸出粉葡萄糖瓊脂培養基用于酵母菌計數。在特殊情況下,若營養瓊脂培養基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌,則應分別點計霉菌和酵母菌細菌菌落數。然后將營養瓊脂培養基上的霉菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數,與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的霉菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較,以菌落數較高的培養基中的菌數為計數結果。
含蜂蜜、王漿的液體制劑,用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定霉菌數,用酵母浸出粉胨葡菌數報告規則宜選取細菌、酵母菌平均菌落數小于300CFU、霉菌宜選擇平均菌萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數,合并計數。
落數小于100CFU的稀釋級,作為菌數報告(取兩位有效數字)的依據。以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數。如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落數小于1時,以<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。
2)薄膜過濾法:采用薄膜過濾法,濾膜孔徑不大于0.45μm,直徑約為50mm。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性水溶性供試液過濾前先用少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量不超過100ml,總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。
取相當于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾。若供試品每1g或1ml所含的菌數較多時,可取適宜稀釋級的供試液1ml進行試驗。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法和沖洗量同“計數方法的驗證”。沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。每種培養基至少制備一張濾膜。
陰性對照試驗??取試驗用的稀釋液1ml,照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
培養和計數??培養條件和計數方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數應不超過100個。菌數報告規則以相當于1g或1ml供試品的菌落數報告菌數;若濾膜上無菌生長,以<1報告菌數(每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品)或<1乘以稀釋倍數的值報告菌數。
(2)控制菌檢查:供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行,增菌培養基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。
陽性對照試驗??進行供試品控制菌檢查時,應陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10-100CFU。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。
陰性對照試驗??取稀釋液10ml照相應控制菌檢查法檢查,作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。
1)大腸埃希菌(Escherichia coli):取供試液10ml(相當于供試品1g、1ml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)的膽鹽乳糖培養基中,培養18-24小時,必要時可延長至48小時。取上述培養物0.2ml,接種至含 5ml MUG培養基的試管內,培養,于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察,同時用未接種的MUG培養基作本底對照。若管內培養物呈現熒光,為MUG陽性;不呈現熒光,為MUG陰性。觀察后,沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液,液面呈玫瑰紅色,為靛基質陽性;呈試劑本色,為靛基質陰性。本底對照應為MUG陰性和靛基質陰性。
如MUG陽性、靛基質陽性,判供試品檢出大腸埃希菌;如MUG陰性,靛基質陰性判供試品未檢出大腸埃希菌;如MUG陽性、靛基質陰性,或MUG陰性、靛基質陽性,均應取膽鹽乳糖培養基的培養物劃線于曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上,培養18～24小時。
若平板上無菌落生長、或生長的菌落與表1所列的菌落形態特征不符,判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表1所列的菌落形態特征相符或疑似,應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗,確認是否為大腸埃希菌。
表1
培養基 | 菌落形態 |
曙紅亞甲藍瓊脂 | 呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色、菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心、圓形,稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤,常有金屬光澤 |
麥康凱瓊脂 | 鮮桃紅色或微紅色,菌落中心呈深桃紅色,圓形,扁平,邊緣整齊,表面光滑,濕潤 |
2)大腸菌群(Coliform):取含適量(不少于10ml)的膽鹽乳糖發酵培養基管3支,分別加入1:10的供試液1ml(含供試品0.1g或0.1ml),1:100的供試液1ml(含供試品0.01g或0.01ml),1:1000試液1ml(含供試品0.001g或0.01ml)另取1支膽鹽2酵培養基加入稀釋液1ml作為陰性對照管。培養18～24小時。
膽鹽乳糖發酵管若無菌生長、或有菌生長但不產酸產氣,判該管未檢出大腸菌群若產酸產氣,應將發酵管中的培養物分別劃線接種于曙紅亞甲藍培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上,培養18-24小時。
若平板上無菌落生長,或生長的菌落與表2所列的菌落形態特征不符或為非培養蘭陰性無芽孢桿菌,判該管未檢出大腸菌群;若平板上生長的菌落與表2所列的菌落形態特征相符或疑似,且為革蘭陰性無芽孢桿菌,應進行確證試驗。
表2
培養基 | 菌落形態 |
曙紅亞甲藍瓊脂 | 呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色,圓形,扁平或稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤 |
麥康凱瓊脂 | 鮮桃紅色或粉紅色,圓形,扁平或稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤 |
確證試驗?? 從上述分離平板上挑選4-5個疑似菌落,分別接種于乳糖發酵管中,培養24-48小時。若產酸產氣,判該膽鹽乳糖發酵管檢出大腸菌群,否則判未檢出大腸菌群。根據大腸菌群的檢出管數,按表3報告1g或1ml供試品中的大腸菌群數。
表3
各供試品量的檢出結果 | 可能的大腸菌群數群數N(個/克或個/毫升) | ||
0.1g或0.1ml | 0.01g或0.01ml | 0.001g或0.001ml | |
+ | + | + | |
+ | + | - | |
+ | - | ||
- | - | <10 |
注:“+”代表檢出大腸菌群;“-”代表未檢出大腸菌群
3)沙門菌(Salmonella):取供試品10g或10ml,直接或處理后接種至適量(不少于200ml)的營養肉湯培養基中,用勻漿儀或其他適宜方法混勻,培養18～24小時。
取上述培養物1ml,接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養基中,培養18～24小時后,分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂(或沙門、志賀菌屬瓊脂培養基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞甲藍瓊脂)培養基的平板上,培養18～24小時(必要時延長至40~48小時)。若平板上無菌生長,或生長的菌落不同于表4所列的特征,判供試品未檢出沙門菌。
表4
培養基 | 菌落形態 |
膽鹽硫乳瓊脂 | 無色至淺橙色,半透明,菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色 |
沙門志賀菌屬瓊脂 | 無色至淡紅色,半透明或不透明,菌落中心有時帶黑褐色 |
曙紅亞甲藍瓊脂 | 無色至淺橙色,透明或半透明,光滑濕潤的圓形菌落 |
麥康凱瓊脂 | 無色至淺橙色,透明或半透明,菌落中心有時為暗色 |
若平板上生長的菌落與表4所列的菌落形態特征相符或疑似,用接種針挑選2～3個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種,培養18-24小時,如斜面未見紅色、底層未見黃色;或斜面黃色、底層無黑色,判供試品未檢出沙門菌。否則,應取三糖鐵瓊脂培養基斜面的培養物進行適宜的生化試驗和血清凝集試驗,確認是否為沙門菌。
(四)結果判定
1.供試品檢出控制菌或其他致病菌時,按一次檢出結果為準,不再復試。
2.供試品的細菌數、霉菌和酵母菌數其中任何一項不符合該品種項下的規定,應從同一批樣品中隨機抽樣,獨立復試兩次,以3次結果的平均值報告菌數。
3.眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數時,必須以兩次復試結果均不得長菌,方可判供試品的霉菌和酵母菌數符合該品種項下的規定。
4.若供試品的細菌數、霉菌和酵母菌數及控制菌3項檢驗結果均符合該品種項下的規定,判供試品符合規定;若其中任何一項不符合該品種項下的規定,判供試品不符合規定。
(五)注意事項
1.藥品在檢驗前,應保持原包裝狀態,不得開啟,以免污染。同時藥物需放置于陰涼干燥處,防止微生物繁殖,以免影響檢驗結果。凡原包裝已被啟開者,應另行取樣。
2.供試品檢驗全過程必須符合無菌技術要求。使用滅菌用具時,不能接觸可能污染的任何器物,滅菌吸管不得用口吹吸。
3.操作間溫度應控制在18～26℃,相對濕度40%～60%。
4.培養基的分裝量不得超過容器的2/3,以免滅菌時溢出。包裝時,塞子必須塞緊塞入2/3,以免松動或脫落造成染菌。
5.培養基配制后應在2小時內滅菌,避免細菌繁殖;已熔化的培養基應一次用完,開啟后不宜再用;且勿用電爐直接熔化瓊脂培養基,應用水浴或微波爐加熱;從供試品稀釋至傾注瓊脂培養基應在1小時內完成。
