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未來可期-CAR-T細胞療法的發展及展望（一）

2021.3.01

引言：
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嵌合抗原受體T細胞療法(CAR-T)是近年來發展非常迅速的一種新型細胞免疫治療技術,CAR-T免疫療法是通過給T細胞裝備能識別特定腫瘤細胞的分子,在識別腫瘤細胞后能引起T細胞的激活和增殖，從而可以有效殺傷腫瘤細胞。2017年,FDA批準兩個CAR-T產品上市,一個是諾華的Kymriah(Tisagenlecleucel，CTL019)，被批準其用于治療3~25歲的兒童和年輕成人急性淋巴細胞白血病(ALL),開啟了惡性血液腫瘤免疫治療的新篇章。另一個獲批的是Kite Pharma 的Yescarta (Axicabtagene Ciloleucel,KTE-C19),用于治療成人復發或難治性大B細胞淋巴瘤，這是第一個用于治療非霍奇金淋巴瘤的CAR-T產品。由于Kymriah 和Yescarta 的受試者中有部分出現了嚴重的細胞因子釋放綜合征(CRS)及神經毒性，嚴重時可危及生命。因此，正確有效地對CRS進行管理和干預，降低CAR-T治療過程中不良事件發生率是臨床上亟須解決的問題。本文將就CAR-T發展、CAR-T在實體瘤中的應用、CAR-T面臨的挑戰以及未來發展方向做一闡述。
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1.CAR-T細胞療法的原理及發展
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Ｔ細胞的活化主要通過雙信號通路完成。第一信號是抗原特異性信號,由Ｔ細胞表面受體(TCR)與抗原肽-主要組織相容性復合物(MHC)的特異性結合構成；第二信號是抗原非特異性信號，它由Ｔ細胞與抗原遞呈細胞(APC)表面的共刺激分子(CM)相互作用來介導。這兩種信號的共同參與了T細胞的活化，誘導Ｔ細胞產生級聯反應，最終使Ｔ細胞可以活化為細胞毒性Ｔ淋巴細胞(CTL)。當CTL與患者體內含有相同抗原肽-MHC分子復合物的腫瘤細胞相遇后，二者特異性結合，刺激CTL產生釋放裂解腫瘤細胞的穿孔素、顆粒酶，直接殺死腫瘤細胞；或者釋放細胞因子，改變腫瘤細胞生存環境，抑制腫瘤細胞的生長，也可通過CTL表面表達的FasL與腫瘤細胞表面的Fas結合，誘導腫瘤細胞凋亡[1]。然而，腫瘤患者體內的T細胞在腫瘤微環境的影響下，T細胞活化受阻，或者T細胞不能識別腫瘤細胞的抗原肽，這就導致了T細胞殺傷作用不足以清除腫瘤細胞，因此通過在體外改造T細胞，使其成為能識別并殺傷腫瘤的細胞，這一想法即是CAR-T的來源。

圖1：T細胞活化雙信號

CAR-T細胞療法治療的原理是通過基因工程技術將識別腫瘤相關抗原(Tumor associated antigen,TAA) 的抗體可變區基因序列與胞內信號區序列在體外進行重組(形成CAR),再通過病毒轉染方式將編碼CAR基因的重組質粒在體外轉進已分離出的患者T淋巴細胞中，使T細胞表面表達能識別腫瘤抗原的受體蛋白，經體外大規模培養擴增后表達特異性嵌合抗原受體的T細胞稱為CAR-T細胞[2]。由于治療使用的Ｔ細胞來源于患者的外周血細胞，整個治療過程沒有免疫排斥反應。當大量CAR-T細胞回輸到患者體內后，CAR能特異性地識別靶向腫瘤細胞的抗原，活化后的Ｔ細胞可以殺傷腫瘤細胞，從而達到治療腫瘤的目的。

根據CAR的胞內結構域，對CAR的設計研究已經進行到了第五代[3]。初代CAR設計相對簡單，由單鏈抗體通過跨膜區域與細胞內信號傳導區免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM,Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)相連,ITAM通常為CD3ζ或FcεRIγ,第一代CAR設計的信號域是單一的信號分子，而腫瘤細胞表面共刺激分子表達減弱或者缺失,因此CAR修飾的T細胞缺乏共刺激-第二信號的支持,T細胞激活后很快由于信號限制而喪失作用，這使得第一代CAR-T細胞在患者體內抗腫瘤效果有限[4]。作為改進,二代CAR在前一代的基礎上引入了一個共刺激分子(如CD28，4-1BB，OX40等),用來激活第二信號，提供雙重活化信號從而加強CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷毒性，這明顯的改善了第一代CAR對T細胞激活不充分的缺點[5, 6]；三代CAR則在二代的基礎上引入多個共刺激分子(如CD28、CD137、OX40等)，多種共刺激分子相互組合可以增強Ｔ細胞內的JNK、NK-kB等信號通路，使得T細胞表現出更強更持久的作用活性，這對增加T細胞的抗腫瘤活性、延長T細胞的增殖能力、生存周期及促進細胞因子(如IL-2、IFN-γ、TNF-α等)的分泌等方面均有顯著的提升。但臨床上第三代CAR研究較少，且三代CAR會造成T細胞刺激閾值降低，可能引起活化信號的泄露，從而誘發細胞因子釋放過量，因此具體作用是否比二代CAR效果好還需要進一步研究[7]。四代CAR屬于新型研究，相比三代CAR其整合了一個活化T細胞核因子轉錄相應元件，它可以使CAR-T細胞在腫瘤區域分泌特定的細胞因子(例如IL-12)，從而可以提高了T細胞在腫瘤微環境中的存活率，招募并活化其它免疫細胞進入腫瘤微環境中進行免疫應答[8]。五代CAR-T就是通用型CAR-T，它以基因編輯技術為基礎，設計可以阻止人體發生排異反應的基因，并且可以進行異體Ｔ細胞的提前制備，隨時提供給患者。但就臨床應用來看，第二代CAR-T細胞療法仍為主流。圖2為CAR發展歷程圖。

圖2：CAR的發展歷程

2.CAR-T在實體瘤中的應用
相比于血液系統腫瘤，實體瘤中CAR-T的應用受到更多因素的限制，一方面，實體瘤發生部位不像血液系統散布全身，CAR-T細胞需抵達實體瘤病灶，并浸潤到腫瘤內部，即使CAR-T細胞能夠浸潤到實體瘤內部，也會面臨其內部免疫微環境的抑制，影響T細胞正常發揮作用；另一方面，實體瘤內部微環境存在偏酸、缺氧及營養缺乏等情況，也不利于CAR-T細胞發揮作用。此外，實體腫瘤缺乏較理想的特異性表面抗原，且具有不同的免疫抑制機制，因此CAR-T細胞免疫治療在實體瘤的療效不及血液腫瘤(特別是B細胞惡性腫瘤)，但其在神經母細胞瘤、非神經母細胞瘤、肉瘤、間皮瘤、胰腺癌等腫瘤中取得了較好的療效。由June博士領導的小組在臨床實驗中，通過靶向間皮素(Mesothelin)的CAR mRNA瞬轉入病人T細胞中，回輸CAR-T細胞后，發現1例胰腺癌轉移的晚期病人和1例晚期間皮瘤病人，均獲得顯著治療效果，沒有任何脫靶毒性發生[9]。HER2基因是受體酪氨酸蛋白激酶家族的成員，在很多腫瘤細胞過表達并且在上皮細胞上也有表達，在臨床實驗中，已經采用第二代CAR-T靶向HER2來治療表達HER2的腫瘤患者[10]。另外，由于腫瘤新生血管與腫瘤的生長轉移密切相關，應用靶向新生血管中過表達的血管內皮生長因子受體2(VEGFＲ-2)的CAR-T細胞進行腫瘤免疫治療，能夠抑制小鼠不同的腫瘤生長，且對正常組織無明顯損傷，進而可以發揮間接抗腫瘤作用[11, 12]。

3.CAR-T?細胞療法面臨的挑戰
CAR-T細胞在腫瘤免疫治療方面擁有很多優勢，它可以利用非限制性的形式特異識別和殺傷表達特定抗原的癌細胞，以單鏈抗體(single chain antibody fragment，scFv)作為抗原識別區段的CAR能夠識別不同種類的抗原，包括糖類和脂類等非蛋白抗原，腫瘤表面的脂類抗原也可以作為靶點，而不再僅局限于蛋白類抗原。這擴大了腫瘤抗原靶點范圍。此外，CAR-T細胞還可以分泌多種細胞因子實現其在體內的持續增殖，對腫瘤細胞有特異識別殺傷作用，同時，這些細胞因子還可以改變腫瘤免疫微環境對免疫細胞的抑制作用。盡管有著諸多優勢，然而，新療法不可避免的會產生一些新問題，特別是在治療過程出現的嚴重毒副作用，其中以細胞因子釋放綜合征(CRS)最頻繁、癥狀最突出。另外，脫靶效應、神經毒性以及插入突變都會影響CAR-T的最終療效。

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