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基因技術：華南虎的一線生機
華南虎 受訪者供圖
?東北虎? 受訪者供圖
虎年接近尾聲，一項由中國科研團隊主導的華南虎和東北虎的高質量基因組研究在《分子生態學資源》（Molecular Ecology Resources）以封面文章形式發表。這一年，另一個團隊主導的孟加拉虎基因組也在預印本上發表。
一年3個虎亞種高質量基因組發表，占現存6個虎亞種的一半。國際著名保護遺傳學家Anubhab Khan在同期雜志上發表評論稱，中國虎年更是虎的基因組年，高質量虎基因組的發表是對虎年最好的慶祝方式。
Khan指出，這是迄今為止最高質量的虎參考基因組之一，其組裝質量甚至可以與家貓的參考基因組相媲美，這對未來虎的相關研究和保育工作具有重要意義。該研究填補了中國最瀕危的物種之一華南虎的基因組信息，為全面了解華南虎遺傳衰退以及該物種的基因拯救提供了更翔實的科學依據。
頂級掠食者的悲哀
虎是歐亞大陸上最大的頂級掠食者，包括9個亞種。由于棲息地的喪失、破碎化和偷獵，所有虎亞種數量急劇下降，巴厘虎、爪哇虎和里海虎在20世紀40年代到70年代相繼滅絕，現存虎亞種只剩下6個。
華南虎（Panthera tigris amoyensis）在所有虎亞種中處于祖先地位。但20世紀90年代末它就被宣布在野外功能性滅絕，成為中國最瀕危的動物之一。
論文共同通訊作者、深圳華大生命科學研究員劉歡告訴《中國科學報》，中國現存兩百多只圈養華南虎，但僅來自于6只野生虎的后代。雖然從種群數量、年齡結構和性別比例上看總體向好，但由于建群者數量過少以及建群者繁殖貢獻不均，近親繁殖無法避免。這會直接導致種群的近交衰退。
Khan指出，虎不僅數量稀少，行蹤神秘，而且生存面臨著各種各樣的威脅。由于這些特征，虎相關的研究很難開展。不僅如此，虎還是一種地緣政治很敏感的物種。因此，很難完全按照保護遺傳學中最理想的保護策略對他們進行保護和保育，進而更好的恢復種群。
在這樣的情況下，借助遺傳學手段保護華南虎成為科學家的一個選擇。
現存的6個虎亞種中的3個亞種擁有參考基因組，其中共有6個染色體水平的虎基因組，包括兩個華南虎基因組、兩個東北虎基因組和兩個孟加拉虎基因組。此外，馬來虎也有一個不錯的基因組發表。
“總的來說，這些基因組已經極大促進了人們對虎進化歷史的理解，以及人們未來如何延續和發展虎種群。這些基因組也可以讓科學家們開發更多的工具進行虎的保育和管理。”Khan強調，雖然目前已經發表了大概 170 個不同深度的虎全基因組測序數據，但在美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中只有4個華南虎的全基因組數據。“鑒于華南虎位于所有虎亞種的祖先位置，因此，此次論文中發布的16個華南虎全基因組數據對于虎的研究極其寶貴。”Khan說。
為了追蹤華南虎近親繁殖歷史并探索可行的遺傳拯救策略，研究團隊決定對華南虎和東北虎的高質量基因組進行系統比較，并對每個亞種進行小規模重測序。
東北林業大學教授徐艷春團隊聯合深圳華大生命科學研究院副研究員蘭天明團隊，以及福建梅花山華南虎繁育研究所、黑龍江東北虎林園、上海動物園、洛陽動物園、南昌動物園、蘇州動物園、韶關動物園等華南虎保護單位，采用多平臺策略成功構建了染色體層級的華南虎、東北虎基因組序列圖譜。
“這是迄今為止最高質量和最好連續性的華南虎和東北虎基因組。”Khan說。
揭秘種群退化歷史和近交程度
通過基因組學分析，他們發現，東北虎和華南虎分化時間大概在7000年前左右。
劉歡介紹，東北虎和華南虎是不同的亞種，之前有研究推斷它們之間的分化時間是6.5萬~10萬年前。“但是我們根據最新的全基因組數據推斷，他們的分化時間為7000年前，比之前計算的分化時間大幅提前。這主要是得益于最新的測序和生物信息分析方法的進步。”
隨后他們發現，兩者分化之后，無論是華南虎還是東北虎，有效種群大小一直處于下降狀態。論文第一作者張樂說，尤其是近5000年，華南虎有效種群共經歷了3個階段的下降。第一個階段是從5000年前到1000年前，從1.47萬只下降到200只；第二階段是1000年前到近100年；第三階段是從1963年開始圈養到現在。
“造成這種下降趨勢的原因可能是，華南虎的種群當時已經呈破碎化趨勢，形成多個相對隔離的小種群，各個小種群之間由于基因交流障礙、近交，以及人為捕殺和環境破壞等因素的共同影響，導致種群快速下降。”張樂對《中國科學報》說。
Khan指出，這次發表的高質量基因組對于準確評估種群近交程度非常關鍵，因為基因組上長的純合片段是評估近交的重要指標，而這一指標的評估高度依賴基因組的連續性。
論文共同通訊作者、深圳華大生命科學研究院副研究員蘭天明告訴《中國科學報》，多種情況都可以造成基因組上長的純合片段，其中最主要的就是近交和種群經歷瓶頸后的奠基者效應。
所謂近交就是具有相同遺傳信息的個體之間交配，其后代的基因組就會變得越來越純合。瓶頸效應是指一個物種的種群規模發生了快速下降，下降到只有極少數個體（瓶頸），然后通過這極少數的個體（奠基者），又恢復到大種群。這時候的大種群因為只有少數的祖先，所以其基因組相似度也會非常高，反應到基因組上也會出現大量長的純合片段。
“我們的研究發現，華南虎基因組中大量長的純合片段都是近交導致的。”蘭天明說，而且，華南虎種群中共享的長的純合片段橫跨了超過66%的基因組區域，這種近交的基因組信號要遠遠大于東北虎。
“這些信息對于華南虎的保護極其重要，因為華南虎在野外已經滅絕，這些圈養個體是華南虎種群復壯以及將來重歸山林的唯一希望。” Khan說。
如何挽救華南虎種群
華南虎嚴重的近交導致了其基因組的純合化。“而純合化就會將本來基因組上有害、但沒有顯現的隱性致病基因顯現出來。這些有害的基因突變就是突變負荷。”論文通訊作者徐艷春說。
他們發現，華南虎整個基因組的突變負荷要明顯高于東北虎，這是預期之中的。有趣的是，在長的純合片段區域的突變負荷，華南虎卻低于東北虎。這說明，華南虎在近交過程中，將大量有害的突變負荷純合化，純合的突變負荷表現出較大的機體傷害，而無法存活或者無法繁殖，進而被從種群中清除。“這個過程就叫做有害突變的凈化作用，這種作用在很多小種群里面可以檢測到。但是這是第一次在華南虎種群中監檢測到這種凈化作用。”徐艷春說。
他進一步解釋說，因為這種凈化作用主要通過攜帶者死亡和失去繁殖能力等來實現，這一發現解釋了華南虎普遍存在的43%的幼子死亡、30%的成年雌性不能繁殖的現象。
也就是說，近交繁殖與遺傳負荷的疊加效應導致幼子死亡和繁殖率降低，從而清除一部分純合的突變負荷。徐艷春指出，目前的華南虎種群全部個體都有血緣關系，突變負荷廣泛存在于所有個體，任何配對繁殖都是近親繁殖，因而會表現出持續的高死亡率、低繁殖率的狀態。所以，“突變負荷的清除和凈化并不能提高種群的安全性”。
Khan認為，此次發布的數據和現有的全基因組數據集，可以一定程度上支持尋找合適的虎亞種對華南虎進行遺傳拯救。由于蘇門答臘虎和東北虎有一定程度的本地適應性，孟加拉虎、馬來虎和印支虎可能是進行遺傳拯救的更好的候選亞種。
徐艷春告訴《中國科學報》，合適的候選亞種主要考慮3方面的問題：歷史上它們是不是有過自然狀態下的基因交流；它們之間分化后是不是已經有了固有的適應各自環境的能力，比如東北虎適應了寒冷環境，但是華南虎并沒有，如果進行基因交流可能會導致不能適應環境而進一步加劇種群衰退；遺傳拯救的雙方之間是否會引入有害基因。
“從我們的基因組分析中發現，馬來虎、印支虎、孟加拉虎的分布區在歷史上本來就是相互連接的，它們一直存在或多或少的基因交流，而且不存在顯著差異的適應，所以可能更適合作為遺傳拯救候選物亞種，但是仍然需要更多方面的考量。”徐艷春說。
此外，他們還發現了170個華南虎特有的突變分布在繁殖、生長和發育相關的基因中。Khan認為，考慮到華南虎本身的低繁殖率，這些位點對于華南虎的保育極其重要。未來可以設計一些單核苷酸位點芯片用于圈養種群，避免這些位點的繁殖傳代。
“這項研究表明，華南虎種群可能需要通過基因拯救的手段才能得以種群恢復。”Khan說。上述發現為了解以虎為代表的大型貓科動物的近交衰退機制提供了豐富的線索和參考基因組。同時，為制定有效可行的華南虎遺傳拯救策略提供了強大的科學證據和支撐。
