cDNA第二鏈的合成方法
cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種：
（1）自身引導法。合成的單鏈eDNA3’端能夠形成一短的發夾結構，這就為第二鏈的合成提供了現成的引物。當第一鏈合成反應產物的DNA—RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段或反轉錄酶合成eDNA第二鏈，最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環，即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA5’端序列出現缺失和重排，因而該方法很少使用。
cDNA合成
（2）置換合成法。該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的DNA RNA雜交鏈不用堿變性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。
從而產生一系列RNA引物，使之成為合成第二鏈的引物。在大腸桿菌DNA聚合酶工的作用下合成第二鏈。
該反應有3個主要優點：①非常有效；②直接利用第一鏈反應產物，無須進一步處理和純化；③不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發夾環。
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