微流控芯片技術應對臨床檢驗醫學考驗（一）
一、微流控與微流控芯片
微流控（Microfluidics）的含義是微尺度下的流體控制，其研究對象是使用微米級通道操控納升級以下微量液體的系統[1-3]。鑒于芯片是實現微流體控制的主要平臺，因而微流控芯片（Microfluidic chip）是微流控的主要研究內容。
微流控芯片的制作主要依托于MEMS（Micro-Electro-Mechanical System）加工工藝，具有在微米尺度級別實現微量流體操控的能力。微流控芯片技術的特點來自于兩個方面：一是微流體的特性微尺度下流體的一系列特殊效應包括層流效應、表面張力及毛細效應、快速熱傳導效應和擴散效應等，這些效應有利于精確流體控制和實現快速反應；二是微加工工藝帶來的結構復雜性微加工工藝具有加工小尺寸、高密度微結構的能力，便于實現各種操作單元的靈活組合與規模集成。因此，樣品前處理、分離與分析、檢測等實驗流程得以在同一芯片上集成化和并行化，從而達到微型化、自動化、低消耗和高效率的目的[4,5]。
微流控研究起始于20世紀90年代，至今已經有二十余年的發展歷史，其間經歷了基礎理論奠定、單元操作技術發展、小規模集成和大規模集成幾個歷史發展階段。至今，微流控技術已經較為成熟，已經在多個領域得到認可并廣為利用,其產業化趨勢亦是愈發明顯[6]。2003年《福布斯》雜志把這項技術評為“影響人類未來15件最重要發明之一”；2004年，美國Business 2.0雜志封面文章將微流控芯片列為“改變世界”的七種技術之一；2006年Nature雜志出版了一期微流控專輯，題名為“本世紀的技術”。
二、微流控體外診斷技術的優勢
體外診斷（In vitro diagnosis, IVD），是指對人體的體液和組織等進行檢測而獲得臨床診斷信息。微流控芯片是體外診斷的有利技術平臺[7,8]，這表現在以下幾個方面：1.應用場景拓展傳統的檢驗設備多為大型儀器，雖然在測試通量和穩定性上具有優勢，但其使用局限于專業實驗室。微流控芯片系統體積小巧、操作簡單，完全可以在門急診、基層醫療單位甚至床邊進行檢測，這極大地拓展了體外診斷的應用空間；2.分析效率的提高集成化和并行化設計的微流控芯片系統，有能力在短時間內提供更為豐富的診斷信息，因而顯著提升了分析效率；3.測試成本的下降微流控芯片使用微反應體系，能夠大幅降低試樣消耗從而降低測試成本[9]。概括來講，微流控體外診斷技術的優勢可以歸結為多、快、好、省四個字，這種分析技術無疑是對現有體外診斷技術的巨大提升。
微流控體外診斷技術已經引起了國家層面的重視。2016年國務院“十三五”國家科技創新規劃中關于體外診斷產品的章節寫到“突破微流控芯片等關鍵技術，開發全自動核酸檢測系統等一批重大產品，研發一批重大疾病早期診斷和精確治療診斷試劑以及適合基層醫療機構的高精度診斷產品，提升我國體外診斷產業競爭力”。由此可見，微流控體外診斷技術的發展已經上升到國家戰略層面。
作者所在研究團隊工作于臨床檢驗第一線，課題組的研究方向是針對臨床檢驗中的痛點問題發展創新微流控診斷技術。經歷了十余年的研究歷程，課題組對于微流控體外診斷技術在臨床檢驗醫學中的應用價值逐步加深了理解。本文中就課題組對于微流控技術的理解以及我們的一些體外診斷應用嘗試與大家分享，希望能夠對檢驗醫學同仁有所幫助。
三、微流控芯片技術在體外診斷領域的應用嘗試
當前，傳統的體外診斷技術已經極為成熟。微流控體外診斷產品若要進入體外診斷市場，勢必要展示出高人一籌的能力。相比較傳統的宏觀檢驗設備，微流控產品最大的市場拓展潛力在于：1.針對傳統產品無法適用的應用環境開發產品；2.發展性能指標和操作便利性具有明顯優勢的顛覆性新產品。一個成功的微流控體外診斷產品，需要在操作便利性、分析速度、分析通量和測試成本等幾個方面達到平衡。以下，我們就課題組在幾個關鍵的臨床檢驗應用領域的研究工作加以介紹。
（一）分子診斷
分子診斷是新興的檢驗醫學領域。隨著熒光定量PCR的推廣，基因檢測技術在臨床醫學中得到了廣泛應用。盡管如此，現有核酸分析平臺的一些不足之處還是限制了分子診斷技術的推廣：1）場地要求嚴格，試劑準備、核酸提取和擴增需要分別在獨立房間內進行，極大限制了該技術在醫療資源有限條件下的開展；2）采用離線式分析，操作復雜、分析周期較長，不利于應對突發性事件；3）現有的熒光定量PCR方法多是針對單一指標檢測設計，對于多重基因檢測無論是操作繁瑣程度還是測試成本均是難以接受的。
分子診斷是微流控芯片技術最具有代表性的應用領域。對于分子診斷應用，微流控芯片最大的貢獻在于該技術有潛力將核酸提取、擴增和檢測集成于同一裝置，因而可擺脫繁瑣操作以及對專業實驗室的依賴。此外，由于反應過程處于封閉的環境中，可以消除交叉污染的可能性。除了功能集成，微流控核酸分析芯片還需要具有一定的分析通量以滿足臨床實際需求。已經商業化的微流控分子診斷產品基本都是針對病原微生物檢測應用，其價值在于：1.實現現場快速檢測；2.解決難于培養鑒定病原（如結核桿菌、病毒、支原體等）鑒定問題。
作者課題組最近發展一種液滴陣列微流控芯片核酸分析系統[10]。這種便攜式系統包含機械、磁力和光學檢測單元，其設計理念是平衡集成、通量、成本及便攜性等關鍵因素，發展適合于現場應用的病原篩查工具。系統所用微流控芯片上設計有多組以狹縫通道連通的串聯微池，全部分析試劑均以油包水形式預存儲于其中。由于表面張力效應，油相可以浸潤微池和狹縫而水相不能。利用磁鐵陣列驅動磁珠在串聯液滴中穿行，程序化完成細胞裂解-核酸結合、磁珠洗滌、核酸洗脫、擴增/檢測等一系列步驟，從而實現自動化和平行化核酸分析。該系統極為緊湊，適合于現場快速檢測及醫院門急診場景下的“隨到隨檢、快速響應”需求。課題組將這一系統用于性傳播疾病病原篩查，淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲脲原體、生殖支原體等四種病原的篩查可在45 min內完成。
圖1 液滴陣列微流控芯片核酸分析系統。A. 分析儀器實物及結構示意圖; B. 分析原理示意圖。
（二）免疫檢測
免疫檢測是臨床檢驗極為重要的領域。目前，臨床免疫檢測的主流技術是化學發光和免疫比濁法，具有靈敏度高和檢測線性范圍寬的優勢。這些檢測方法一般使用大型儀器，分析通量較高。但是，由于購置成本和儀器體積因素，這類設備僅適合于大型實驗室使用。基于試紙條的膠體金法是快速免疫檢測的主流技術，該技術雖然使用方便，但在靈敏度和線性范圍方面受限。因此，臨床檢驗工作需要一種兼具操作便利性、檢測靈敏度和定量準確性的免疫檢測平臺，這對于急診以及基層醫療單位尤其重要。
圖2 液滴陣列微流控芯片免疫分析系統。A. 分析儀器結構示意圖;B. 分析原理示意圖。
作者課題組發展了一種微流控芯片免疫化學發光分析系統[10]。與前面介紹的液滴陣列微流控芯片核酸分析系統類似，免疫化學發光分析系統采用具有平行串聯微池結構的微流控芯片。免疫化學發光分析相關的一組試劑以油包水液滴形式預存儲于指定微池中。由于表面張力效應，狹縫可以隔絕水相溶液。通過程序化的磁力操控，在液滴間轉移磁珠，從而將化學發光免疫分析涉及的一系列操作，包括抗原-抗體結合、磁珠洗滌、酶促發光及信號檢測，在芯片分析系統內自動完成。研究利用發展的微流控化學發光免疫分析方法，進行了C反應蛋白(CRP)與降鈣素原(PCT)兩種感染性疾病標記物的同步檢測。在優化的實驗條件下，整個過程可在15 min內完成。CRP與PCT檢測限分別為0.31 ng?mL-1和0.09 ng?mL-1，標準曲線線性范圍分別為0.8-200 ng?mL-1和0.5-60 ng?mL-1，對照測試提示微流控芯片系統與商品化儀器檢測結果高度一致。
