PCR技術反應五要素是什么？
1、引物
PCR 反應成功擴增的一個關鍵條件是正確設計寡核苷酸引物。引物設計一般遵循以下原則:①引物長度:一般為15～30bp,常用為 20bp 左右,引物太短,就可能同非靶序列雜交,得到不需要的擴增產物。②引物擴增跨度:以200～500bp 為宜,特定條件下可擴增至10kb。③引物堿基:G+C 含量以40%～60%為宜,G+C 太少擴增效果不佳,G+C 過多易出現非特異條帶。A、T、G、C 最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列。④避免引物內部出現二級結構:避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。⑤引物量:每條引物的濃度為0.1～0.5μmol/L,以最低引物量產生所需要的結果為好;引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。⑥引物的特異性:引物應與同一基因組中其他核酸序列無明顯的同源性,即只與目標 DNA 區段有較高的同源性。
引物的作用有兩個:①按照堿基互補的原則,與模板 DNA 上的特定部位雜交,決定擴增目的序列的特異性;②兩條引物結合位點之間的距離決定最后擴增產物的長度。
2、模板
PCR 反應是以 DNA 為模板(template)進行擴增,DNA 可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子;可以是線狀分子,也可以是環狀分子,通常來說,線狀分子比環狀分子的擴增效果稍高。模板的數量和純度是影響 PCR 的主要因素。在反應體系中,模板數量一般為102～105拷貝,1ng 的大腸桿菌 DNA 就相當于這一拷貝數。PCR 甚至可以從一個細胞、一根頭發、一個孢子或一個精子中提取的 DNA 為分析目的序列。模板量過多則可能增加非特異性產物。盡管模板 DNA 的長短不是 PCR 擴增的關鍵因素,但當用高分子量的 DNA(>10kb)作模板時,可用限制性內切酶先進行消化(此酶不應切割其中的靶序列),擴增效果會更好。例如,用腺病毒載體(大小約為30kb)為模板時,先用特異的限制性內切酶(Pac Ⅰ)消化處理后,PCR 擴增效果會明顯提高。
單、雙鏈 DNA 和 RNA 都可作為 PCR 的模板,如果起始模板為 RNA,需先通過逆轉錄得到第一條cDNA 鏈后才能進行 PCR 擴增。
3、DNA 聚合酶
DNA 聚合酶(DNA polymerase)是推動 PCR 反應進行的機器,如果沒有它的存在,PCR 反應就不可能進行。耐熱 DNA 聚合酶包括 Taq DNA 聚合酶、Tth DNA 聚合酶、Vent DNA 聚合酶、Sac DNA 聚合酶以及修飾 Taq DNA 聚合酶等,以 Taq DNA 聚合酶的應用最廣泛。Taq DNA 聚合酶是1988年由Saiki 從水棲嗜熱菌(Thermus aquaticus)中分離提純的耐熱 DNA 聚合酶,分子量為94000,由832個氨基酸殘基組成,熱穩定性好,在75～80℃條件下每個酶分子每秒鐘可聚合約150個核苷酸,是目前 PCR 中最為常用的聚合酶。一般 Taq DNA 聚合酶的活性半衰期為:92.5℃ 130min,95℃ 40min,97℃ 5min。酶的活性單位定義為74℃下30min 摻入10nmol/L dNTP 到核酸中所需的酶量。目前人們又發現許多新的耐熱 DNA 聚合酶,這些酶的活性在高溫下可維持更長時間。
4、dNTP
脫氧核苷酸是 DNA 的基本組成元件,為 DNA 合成所必需。PCR 中使用脫氧核苷酸通常是4種脫氧核苷酸的等摩爾混合物,即 dATP(腺嘌呤脫氧核糖核苷三磷酸)、dGTP(鳥嘌呤脫氧核糖核苷三磷酸)、dCTP(胞嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸)和 dTTP(胸腺嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸),通常統稱為 dNTP。
PCR 擴增效率和 dNTP 的質量與濃度有密切關系,dNTP 干粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP 溶液呈酸性,使用時應配成高濃度,以1mol/L NaOH 或1mol/L Tris-HCl 的緩沖液為宜,pH 調節到7.0～7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。多次凍融會使 dNTP 降解。在 PCR 反應中,dNTP 的濃度應為50～200μmol/L,尤其注意4種 dNTP 的濃度要相等(等物質的量配制),如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(偏高或偏低),就會增加錯配概率。dNTP 濃度過低又會降低 PCR 產物的產量。dNTP 能與 Mg2+?結合,使游離的?Mg2+濃度降低。
5、?Mg2+
反應體系中游離?Mg2+的濃度對 PCR 反應中耐熱 DNA 聚合酶的活性、PCR 擴增的特異性和 PCR 產物量有顯著的影響。反應體系中?Mg2+濃度低時,會降低 Taq DNA 聚合酶的催化活性,得不到足夠的 PCR 反應產物;過高時,非特異性擴增增強。此外,?Mg2+濃度還影響引物的退火、模板與 PCR 產物的解鏈溫度、產物的特異性、引物二聚體的生成等。在標準的 PCR 反應中,?Mg2+的適宜濃度為1.5～2.0mmol/L。值得注意的是,由于 PCR 反應體系中的 DNA 模板、引物和 dNTP 磷酸基團均可與?Mg2+結合從而降低游離?Mg2+的實際濃度,因此,?Mg2+的總量應比 dNTP 的濃度高0.2～2.5mmol/L。如果可能的話,制備 DNA 模板時盡量不要引入大劑量的螯合劑(即 EDTA)或負離子(如
),因為它們會影響?Mg2+的濃度。
