普通PCR、實時熒光定量PCR、數字PCR技術的功能區別

?? 一、普通PCR技術

? ? KARY MULLIS （1944.12.28-2019.8.7）

? ? Kary Mullis于1983年發明了聚合酶鏈式反應法（polymerase chain reaction ，PCR），據說是載著女友開車的時候，忽然靈光一閃，想到了PCR原理（論開車的好處）。Kary Mullis于1993 年獲諾貝爾化學獎。《紐約時報》如此評價：" 具有高度原創性和重大意義，幾乎將生物學分為 PCR 前和 PCR 后兩個時代。

? ? PCR的原理：在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。
? ? 普通PCR的優點

? ? 經典方法，國際和國內標準齊全

? ? 儀器試劑成本較低

? ? PCR產物可以回收后做其他分子生物學實驗

? ? 普通PCR的缺點

? ? 容易污染

? ? 操作繁瑣

? ? 只能定性分析

? ? 敏感性中等

? ? 存在非特異性擴增，當非特異條帶與目的條帶大小一樣時無法區分

? ? 基于毛細管電泳的PCR

? ? 針對普通PCR的缺點，一些廠家推出了基于毛細管電泳原理的儀器，將PCR擴增后電泳的步驟在毛細管中完成，靈敏度更高，可以區分幾個堿基的差異并且通過MAERKER可以計算出擴增產物的含量。缺陷是仍然需要將PCR產物打開后放入儀器，仍然存在很大的污染風險。
? ? 二、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR ，qPCR）技術

? ? 熒光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。熒光定量PCR的發展史是一部ABI、羅氏和伯樂等巨頭的蕩氣回腸的斗爭史，感興趣的可以去查查。該技術是目前最成熟，使用最廣泛的半定量PCR技術。

? ??熒光染料法（SYBR Green I）：

? ? SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結合染料，與雙鏈DNA非特異性結合。在游離狀態下，SYBR Green 發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000倍。所以，一個反應發出的全部熒光信號與出現的雙鏈DNA量呈比列，且會隨擴增產物的增加而增加。由于染料是與雙鏈DNA的非特異性結合，因此可能產生假陽性的結果。

? ? 熒光探針法（Taqman 技術）：

? ? PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時（在延伸階段），Taq 酶的 5' —— 3' 切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步。臨床檢測中Taqman探針法是最常用的檢測方法。
? ? qPCR的優點

? ? 方法成熟，配套儀器試劑齊全

? ? 試劑成本中等

? ? 操作簡單

? ? 檢測敏感性高，特異性高

? ? qPCR的缺點

? ? 1.目的基因發生突變導致漏檢

? ? 2.低濃度模板檢測結果無法確定

? ? 3.使用標準曲線進行定量檢測時誤差較大。

? ? 三、數字PCR（digital PCR ，dPCR）技術

? ? 數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR，數字PCR能夠直接讀出DNA/RNA分子的個數，是對起始樣品核酸分子的絕對定量。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了dPCR的概念。

? ? 2006年，Fluidigm公司第一個生產商業化的基于芯片的dPCR儀。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系統，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系統，采用高密度的納升級微流控芯片技術，將樣本均勻的分配至20 000個單獨的反應孔中。
? ? 2011年，Bio-Rad公司推出了基于微滴的QX100 dPCR儀，利用油包水技術，將樣品平均分配到20 000個微滴油包水中，利用微滴分析儀對微滴進行分析。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR儀，在高壓氣體驅動下，將每個標準反應體系分割成包含100萬至1 000萬個皮升級別微滴的反應乳液。

? ?至此數字PCR就形成了2大派別，芯片式和微滴式。不論是哪種數字PCR，其核心原理都是有限稀釋，終點PCR和泊松分布。將含有核酸模板的標準PCR反應體系，平均分配成幾萬個PCR反應，分配到芯片或微滴中，使每個反應中盡可能含有一個模板分子，進行單分子模板PCR反應，通過讀取熒光信號的有或無進行計數，經過統計學泊松分布的校準進行絕對定量。

? ? dPCR的優點

? ? 實現絕對定量

? ? 更高的敏感性和特異性

? ? 可以檢測低拷貝樣品

? ? dPCR的缺點

? ? 1.儀器設備和試劑昂貴

? ? 2.操作復雜，檢測時間長

? ? 3.檢測范圍較窄

? ? 目前三代的PCR技術各有各的優缺點，也各有各的應用領域，并不是一代取代一代的關系。技術的不斷進步給PCR技術注入了新的活力，使其能解鎖一個又一個的應用方向，使核酸檢測更方便、更準確。