茶葉中真菌毒素的污染及快速定量檢測（一）
一、真菌毒素概述
真菌毒素是某些真菌在一定環境條件下產生的，危害人和動物的次級毒性代謝產物?。迄今發現超過400種真菌毒素，主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、單端孢霉烯族毒素?中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和Ｔ-２?玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、雜色曲霉素、桔青霉素等。真菌毒素主要由曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬中產生。這些微生物廣泛分布在植物、土壤和空氣當中，可能污染谷物、大豆、堅果、水果、調味料、可可、咖啡、中草藥等植物性食物及其制品（如葡萄、啤酒）、飼料等。并可能在原料、加工、儲藏等環節污染食物或飼料，從而進入食物鏈?。世界糧農組織統計顯示，每年全世界有25％的谷物受到真菌毒素污染，由此，美國年均損失約93.2億美元?。另外谷類和堅果中的真菌毒素可能是非洲、亞洲和南美洲消費者面臨的食品中最主要的不安全因素?。
二、茶葉中存在哪些真菌毒素
近年來關于茶葉尤其普洱茶等經過微生物發酵茶葉的真菌毒素污染已引起消費者的關注。茶葉是指茶樹的干燥嫩葉與嫩莖，已成為世界上除了水之外消費最多的飲料，其安全性對消費者的健康以及茶葉產業發展尤其重要。產毒真菌分布廣泛，茶園土壤和加工車間等都有可能存在，茶葉加工可能受到產毒真菌污染。雖然干燥環節可能殺滅紅茶、綠茶中的大多數微生物，但干燥之后如果包裝、貯藏不當，尤其茶葉吸濕受潮之后，可能受到真菌和真菌毒素污染。而普洱茶、茯磚茶等黑茶后發酵過程及產品中本身存在曲霉屬、青霉屬等多種真菌菌種，?也可能受真菌毒素污染?。但目前僅見印度對紅茶的黃曲霉素做了限量規定（30ug/kg）。GB2761—2017未規定茶葉制品真菌毒素限量。
2.1.?紅茶真菌毒素相關研究
紅茶是指茶樹鮮葉經過萎凋、揉捻、發酵、干燥等步驟生產出來的茶葉產品，是世界上產量最大的茶葉類別，也是除中國、日本外其他國家的主要消費品種，因此目前關于紅茶污染真菌毒素的研究報道相對較多。
早在1974年，日本學者Hitokoto等就開展了東京市售茶葉毒素產生菌污染的研究，從東京市售的19份紅茶樣品中，分離得到259?株泡盛曲霉，檢測發現這些真菌可在酵母蔗糖培養基上產生雜色曲霉素，表明紅茶受到了毒素產生菌的污染。Abdel-Hafez等應用薄層層析測定發現，4份紅茶粉樣品受到黃曲霉毒素B1和B2污染，含量為2.8~2.17?mg/kg。Hasan?等從埃及市售的20個品牌紅茶粉中分離得到多株黃曲霉，檢測發現其中15?株可產黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2，5株可產生黃曲霉毒素B1和B2；進一步研究發現，茶葉接種產毒菌株后，可產生黃曲霉素，且毒素含量隨含水量增大而增加；茶葉含水量45％，28℃，培養20d的條件下毒素含量最大，可達26～?81ug/kg。Elshafie?等從購于馬斯喀特的４?個品牌48份紅茶樣品中，分離鑒定出５種真菌，進一步檢測發現分離的25株黃曲霉均不產生黃曲霉毒素。Ostry等在紅茶中檢測到了可能產生黃曲霉素的黃曲霉菌株。Martins等測定發現，購于里斯本的18份紅茶樣品中，有16份樣品污染了伏馬菌素Ｂ1，含量為80~280ｍｇ/ｋｇ，未檢測到伏馬菌素Ｂ2。Miraglia報道，1995-1998年歐盟國家檢測了139份紅茶樣品，其中8份樣品中赭曲霉毒素A陽性，?含量為0.03~10.3?μｇ/ｋｇ。Hasan發現接種黃曲霉菌株之后，脫咖啡因紅茶中的黃曲霉毒素是普通茶葉的5倍。Ｒ?ｅｚáｃ等分析發現，布拉格市售的10個紅茶樣品受到真菌污染，但符合捷克的標準，產毒試驗表明分離的真菌不產黃曲霉毒素。Santos?等應用酶聯免疫吸附法檢測了西班牙市售的包括紅茶在內的84個藥用或芳香植物中的黃曲霉毒素、赭曲霉毒素Ａ、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、Ｔ-2毒素、桔青霉素和伏馬菌素，發現樣品普遍受到毒素污染。Mogensen?等發現從紅茶中分離到的Aspergillusacidus不產生赭曲霉毒素A、伏馬菌毒素Ｂ2?和Ｂ4。Monbaliu等建立了一個可同時測定27?種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯質譜法，檢測了91份茶葉樣品，結果只有1?份樣品檢測到伏馬菌素B1（76ug/kg）。
研究發現紅茶中真菌數量及毒素含量與含水量有關，茶葉受潮后真菌會大量繁殖、產生毒素。真菌孢子在加工的很多環節都可能污染紅茶、綠茶等茶葉產品，但真菌生長及產生毒素需要一定的水分，如果茶葉干燥徹底、貯藏過程不受潮，即使茶葉含有真菌孢子，但不會繁殖，也不會產生真菌毒素。因此，對于紅茶、綠茶等茶葉加工企業來說，可以通過徹底干燥、及時包裝或真空包裝、儲存運輸過程不受潮，來降低或杜絕真菌毒素污染的風險。對于茶葉消費者來說，打開包裝之后應檢查茶葉是否霉變、開封后的茶葉必須干燥存放、勿飲用霉變茶葉，避免受到真菌毒素危害。
2.2.?黑茶真菌毒素研究
?黑茶指制造工序為鮮葉經殺青、揉捻、渥堆（后發酵）、干燥，成品茶呈油黑或黑褐的茶種。主要有云南普洱茶、湖南茯磚茶、四川康磚茶、廣西六堡茶等。由于獨特品質及良好的保健功效，近年來黑茶產量及消費量都逐漸增大。但普洱茶等黑茶加工有一個多種微生物作用的后發酵過程，這些微生物可能產生毒素。如普遍認為的普洱茶發酵優勢菌黑曲霉是一般公認安全的微生物，但近年來發現黑曲霉的某些菌株可能產生赭曲霉毒素和伏馬毒素；茯磚茶的優勢菌散囊菌屬的一些菌種也可產生赭曲霉毒素和伏馬毒素等真菌毒素。目前有關黑茶真菌毒素污染的風險已經引起了廣泛的關注，部分學者開展了相關研究。
Hitokoto?等分析了共１１?份茶葉樣品，其中２?份為普洱茶樣品，發現普洱茶真菌數量最多，優勢菌是雜色曲霉和聚多曲霉；其中１?株雜色曲霉在小麥培養基上產生了雜色曲霉素，但在綠茶中未產生毒素；聚多曲霉在葡萄糖酵母和小麥培養基上均不產生毒素。陳秋娥分析了44?件臺灣市售普洱茶樣品，未檢測到黃曲霉毒素、赭曲霉毒素Ａ、雜色曲霉素和桔青霉素；同時陳秋娥還研究了黃曲霉在普洱茶發酵中的產毒素情況，發現不接種黃曲霉菌株的普通發酵（對照組）和不滅菌茶葉接種黃曲霉菌株的發酵樣品均未檢出黃曲霉毒素；滅菌茶葉接種黃曲霉菌株的樣品檢出黃曲霉毒素（1.05?ug／kg），該研究表明正常的普洱茶發酵過程不會產生黃曲霉毒素。Abe等應用HPLC?檢測發現，從普洱茶中分離的黑曲霉不產生赭曲霉毒素A和伏馬菌素。Mogensen等檢測發現，從普洱茶樣品中分離的Aspergillusacidus不產生赭曲霉毒素A、伏馬菌毒素Ｂ2和Ｂ4。ＨＯＵ?等檢測發現，應用黑曲霉和炭黑曲霉（Ａ.Carbonarius）發酵的茶葉樣品不含赭曲霉毒素A和伏馬菌素。陳建玲等隨機抽查廣州某茶葉市場濕倉儲存的普洱茶７０?份樣品，發現其中８?份樣品（11.43％）?黃曲霉毒素Ｂ1>5μｇ/ｋｇ，63份樣品（90％）脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染＞?１?ｍｇ/ｋｇ，伏馬毒素（Ｂ1?和Ｂ1）和Ｔ-２?毒素毒素含量雖然都分別小于１mg/kg?和100μｇ/ｋｇ，但在樣品中均可檢出，應引起廣泛重視。ZHANG等應用免疫層析法檢測，并用高效液相色譜?質譜法（HPLC-MS）驗證，發現５?份普洱茶樣品都含有黃曲霉毒素，含量為４.９?～５９.３?μｇ/ｋｇ。柳其芳應用酶聯免疫測試盒測定，發現普洱茶黃曲霉毒素污染水平超過２０?μｇ/ｋｇ?的有１０?份（16.6％），脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染水平超過1000μｇ／?ｋｇ?的有13份（23.0％）；玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、赭曲霉毒素、Ｔ-２?毒素在樣品中均可檢出。Haas等檢測了３６?份普洱茶樣品，未檢測到黃曲霉素（Ｂ1，Ｂ2，Ｇ1和Ｇ2）和伏馬菌素（Ｂ１，Ｂ２?和Ｂ３），４?份樣品檢測到赭曲霉毒素Ａ，含量為0.６５?～?９４.７?μｇ/ｋｇ。趙浩軍等應用ＨＰＬＣ?方法檢測了市售普洱茶２?份樣品，均未檢出黃曲霉毒素Ｂ1。
陳秋娥接種黃曲霉菌株發酵普洱茶的研究表明，正常的普洱茶發酵過程不會產生黃曲霉素，Ａbe等、Ｍogensen?等和ＨOU等３?個獨立研究都表明，普洱茶發酵過程的曲霉菌種不產生赭曲霉毒素Ａ?和伏馬菌素。以上研究均表明，正常的普洱茶發酵不會產生真菌毒素。由于樣品及測定方法不同，關于普洱茶產品中真菌毒素檢測的報道不一致。陳建玲等、ＺＨＡＮＧ?等和柳其芳檢測的普洱茶樣品較大程度受到黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素和Ｔ-２?毒素污染；而陳秋娥?和趙浩軍等分別檢測了44和2份市售普洱茶樣品，未檢出毒素。Ｈaas?等分析了36?份樣品的８?種真菌毒素，僅4份樣品檢測到赭曲霉毒素Ａ。
近年來有關黑茶的真菌毒素污染引起了廣泛關注，應加強過程控制，檢測發酵過程真菌是否產生毒素；篩選、應用不產毒素菌株發酵并監測是否產毒，建立安全的黑茶發酵技術體系。
2.3.?其他茶葉真菌毒素研究
有關綠茶、白茶中真菌毒素的研究不多，僅Ｒｅｅｚáｃˇｏｖá?等分離１０?份捷克市售綠茶樣品中的真菌，發現均不產生黃曲霉毒素。Ｓantos等檢測了西班牙市售的綠茶和白茶樣品，發現部分檢測樣品受到黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、Ｔ-２?毒素和桔青霉素污染。趙浩軍等檢測了2份綠茶樣品，未檢出黃曲霉毒素Ｂ1。
綜上，無論黑茶、紅茶、綠茶都可能受到真菌毒素的污染。飲用真菌毒素污染的茶葉對健康不利，但另一方面，也有大量文獻研究表明，綠茶、紅茶、普洱茶等都具有“解毒”作用，可以降低黃曲霉毒素等真菌毒素的毒性。因此今后應開展茶葉真菌毒素的風險評估研究，準確評估茶葉中真菌毒素對人體健康的風險。我國茶葉加工工藝與制品類別眾多，生產廠家也很多，且多數規模不大，因此更應重視茶葉可能受到毒素污染的情況。建議開展不同品種茶葉制品真菌毒素檢測研究，普查各類茶葉制品受到真菌毒素污染情況，并根據真菌毒素污染情況，制定茶葉毒素的限量指標。對于有微生物參與發酵的茶類（如黑茶），通過應用不產毒素菌株發酵、監控發酵過程毒素等措施建立安全的發酵技術。我國茶葉企業與監管機構應加強茶葉毒素的過程控制及監測，降低茶葉受到真菌毒素污染的風險，以保障飲用安全。
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技術原理
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標準
