透射電鏡樣品制備要求有哪些
透射電鏡樣品制備步驟：
一，取材:組織塊小于1立方毫米
二，固定:
2.5%戊二醛,徳酸緩沖液配制固定2小時或更長時間。
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次1%餓酸固定液固定2-3小時
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
三，脫水:
50%乙醇15-20分
70%乙醇15-20分
90%乙醇15-20分
90%乙醇90%丙酮(1:1)15-20分
90%丙酮15-20分以上
在4度冰箱內進行
100%丙酮室溫15-20分三次
四，包埋:純丙酮+包埋液(2:1)室溫3-4小時
純丙酮+包埋液(1:2)室溫過夜
純包埋液37度2-3小時
五，固化:37度烘箱內過夜
45度烘箱內12小時
60度烘箱內24小時
六，LKB-1型超薄切片機切片50-60nm
七，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色
八，透射電鏡觀察、拍片
兩大方法
負染色技術
負染色技術簡單快速，可以顯示生物大分子、細菌、分離的細胞器以及蛋白晶體等樣品的形態、結構、大小以及表面結構的特征。尤其在病毒學中，負染色技術有著廣泛的應用。
樣品要求：①透射電鏡樣品懸液的純度不要求很純，但是如果雜質太多，如大量的細胞碎片，培養基殘渣，糖類以及各種鹽類結晶的存在都會干擾染色反應和透射電鏡的觀察。尤其是不能有過多的糖類，因為在電子束的轟擊下，糖類容易碳化而有礙觀察，因此樣品要適當提純。②樣品懸液的濃度要適中，太稀在透射電鏡下很難找到樣品，太濃樣品堆積影響觀察。
操作流程：吸取樣品懸液滴到有膜的銅網上，靜置數分鐘，然后用濾紙吸去多余的液體，滴上負染色液，染色1～2min后濾紙吸去負染色液，待干后用于透射電鏡觀察。
超薄切片技術
超薄切片技術是為透射電鏡觀察提供薄樣品的專門技術，是生物學中研究細胞超微結構最常用的技術。廣泛應用于生物體的各種細胞的超微結構觀察。一般厚度在10～100nm的切片稱為超薄切片，制作這種切片的技術叫做超薄切片技術。超薄切片制作的過程包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個環節，和一般光學顯微鏡的石蠟切片過程相似。但是，超薄切片切片過程更為細致與復雜，要求更嚴格，而且所用的試劑比較昂貴、配制復雜、強致癌。
具體操作步驟、注意事項如下：
1、取材和前固定：
快速的切取大小為0.5~1.0mm3的樣品塊，一分鐘內把組織(樣品)塊浸入2.5%戊二醛溶液，每個離心管內裝20以上的樣品塊，作為一個樣送到平臺。要求：①取材選擇部位要準確可靠，確保每塊材料都是要觀察的部位。②所有植物樣品一定要抽真空，能夠沉底的樣品也抽真空15min，不能沉底的樣品一定要抽真空致沉底。③細菌、散在細胞等不能成塊的樣品，加戊二醛固定液，離心沉淀后送到平臺，由平臺工作人員處理。④泡在前固定液的材料最多可以放2周。
2、漂洗：沖洗3次，每次15min。
3、后固定：加入1%鋨酸處理到樣品變黑。植物樣品一般處理2.5h，真菌、細菌一般處理2h，動物樣品處理1h。注意事項：①鋨酸劇毒物質，易揮發，操作時要在毒品柜中謹慎使用。②鋨酸比較昂貴，需特別節約使用。
4、漂洗：沖洗3次，每次15min。
5、脫水：室溫下，丙酮30%-50%-70%-80%-90%每級作用30min，純丙酮在作用3次，每次作用30min。
6、滲透：其目的是使包埋劑逐步滲入組織細胞內。植物樣品需要的滲透梯度多、滲透時間長。其他透射電鏡樣品可以適當減少或縮短滲透梯度和時間。
7、包埋：用牙簽將滲透好的樣品挑到包埋板中，45℃聚合12h，60℃聚合36～48h。
8、超薄切片：超薄切片的切片面積最大不能超過0.5mm×0.3mm，比較難切的植物樣品要求切片面積更小。超薄切片是在超薄切片機上進行，但是切出比較理想的超薄切片，卻是一件不容易的工作。做好需要有滲透、包埋好的包埋塊，還要有好的切刀以及操作者的熟練技術等。超薄切片前期需要準備載網和支持膜、修塊、制刀等，前期準備工作至少需要半天時間。超薄切片是極其精細、耗費眼力的工作，需要靜下心來慢慢操作，切好一個透射電鏡樣品至少需要1小時。
9、正染色：由于生物樣品主要由碳、氫、氧、氮等輕元素組成。這些元素原子對電子的散射能力很弱，相互之間的差別也很小。尤其生物超薄切片被樹脂所包埋，這些包埋樹脂對電子的散射能力與樣品本身差別很小。因此透射電鏡生物樣品超薄切片觀察時像的反差極弱。為了提高圖像的反差，要對超薄切片進行電子染色。這里所謂電子染色是根本不同于光學顯微鏡的染色，它是利用重金屬鹽(如鉛鹽、鈾鹽等)與細胞的某些成分或結構結合，由于重金屬對電子散射能力很強，使那些與其結合的結構或成份對電子散射能力增強，從而達到提高樣品本身反差的。目前最常用的染色劑是醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液。操作流程是：超薄切片先檸檬酸鉛染色10分鐘，去二氧化碳的雙蒸水清洗3次，再用醋酸鈾染色30分鐘，雙蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射電鏡觀察。
