透射電鏡樣品制備要求有哪些
透射電鏡樣品制備步驟:
一,取材:組織塊小于1立方毫米
二,固定:
2.5%戊二醛,徳酸緩沖液配制固定2小時或更長時間。
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次1%餓酸固定液固定2-3小時
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
三,脫水:
50%乙醇15-20分
70%乙醇15-20分
90%乙醇15-20分
90%乙醇90%丙酮(1:1)15-20分
90%丙酮15-20分以上
在4度冰箱內進行
100%丙酮室溫15-20分三次
四,包埋:純丙酮+包埋液(2:1)室溫3-4小時
純丙酮+包埋液(1:2)室溫過夜
純包埋液37度2-3小時
五,固化:37度烘箱內過夜
45度烘箱內12小時
60度烘箱內24小時
六,LKB-1型超薄切片機切片50-60nm
七,3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色
八,透射電鏡觀察、拍片
兩大方法
負染色技術
負染色技術簡單快速,可以顯示生物大分子、細菌、分離的細胞器以及蛋白晶體等樣品的形態、結構、大小以及表面結構的特征。尤其在病毒學中,負染色技術有著廣泛的應用。
樣品要求:①透射電鏡樣品懸液的純度不要求很純,但是如果雜質太多,如大量的細胞碎片,培養基殘渣,糖類以及各種鹽類結晶的存在都會干擾染色反應和透射電鏡的觀察。尤其是不能有過多的糖類,因為在電子束的轟擊下,糖類容易碳化而有礙觀察,因此樣品要適當提純。②樣品懸液的濃度要適中,太稀在透射電鏡下很難找到樣品,太濃樣品堆積影響觀察。
操作流程:吸取樣品懸液滴到有膜的銅網上,靜置數分鐘,然后用濾紙吸去多余的液體,滴上負染色液,染色1~2min后濾紙吸去負染色液,待干后用于透射電鏡觀察。
超薄切片技術
超薄切片技術是為透射電鏡觀察提供薄樣品的專門技術,是生物學中研究細胞超微結構最常用的技術。廣泛應用于生物體的各種細胞的超微結構觀察。一般厚度在10~100nm的切片稱為超薄切片,制作這種切片的技術叫做超薄切片技術。超薄切片制作的過程包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個環節,和一般光學顯微鏡的石蠟切片過程相似。但是,超薄切片切片過程更為細致與復雜,要求更嚴格,而且所用的試劑比較昂貴、配制復雜、強致癌。
具體操作步驟、注意事項如下:
1、取材和前固定:
快速的切取大小為0.5~1.0mm3的樣品塊,一分鐘內把組織(樣品)塊浸入2.5%戊二醛溶液,每個離心管內裝20以上的樣品塊,作為一個樣送到平臺。要求:①取材選擇部位要準確可靠,確保每塊材料都是要觀察的部位。②所有植物樣品一定要抽真空,能夠沉底的樣品也抽真空15min,不能沉底的樣品一定要抽真空致沉底。③細菌、散在細胞等不能成塊的樣品,加戊二醛固定液,離心沉淀后送到平臺,由平臺工作人員處理。④泡在前固定液的材料最多可以放2周。
2、漂洗:沖洗3次,每次15min。
3、后固定:加入1%鋨酸處理到樣品變黑。植物樣品一般處理2.5h,真菌、細菌一般處理2h,動物樣品處理1h。注意事項:①鋨酸劇毒物質,易揮發,操作時要在毒品柜中謹慎使用。②鋨酸比較昂貴,需特別節約使用。
4、漂洗:沖洗3次,每次15min。
5、脫水:室溫下,丙酮30%-50%-70%-80%-90%每級作用30min,純丙酮在作用3次,每次作用30min。
6、滲透:其目的是使包埋劑逐步滲入組織細胞內。植物樣品需要的滲透梯度多、滲透時間長。其他透射電鏡樣品可以適當減少或縮短滲透梯度和時間。
7、包埋:用牙簽將滲透好的樣品挑到包埋板中,45℃聚合12h,60℃聚合36~48h。
8、超薄切片:超薄切片的切片面積最大不能超過0.5mm×0.3mm,比較難切的植物樣品要求切片面積更小。超薄切片是在超薄切片機上進行,但是切出比較理想的超薄切片,卻是一件不容易的工作。做好需要有滲透、包埋好的包埋塊,還要有好的切刀以及操作者的熟練技術等。超薄切片前期需要準備載網和支持膜、修塊、制刀等,前期準備工作至少需要半天時間。超薄切片是極其精細、耗費眼力的工作,需要靜下心來慢慢操作,切好一個透射電鏡樣品至少需要1小時。
9、正染色:由于生物樣品主要由碳、氫、氧、氮等輕元素組成。這些元素原子對電子的散射能力很弱,相互之間的差別也很小。尤其生物超薄切片被樹脂所包埋,這些包埋樹脂對電子的散射能力與樣品本身差別很小。因此透射電鏡生物樣品超薄切片觀察時像的反差極弱。為了提高圖像的反差,要對超薄切片進行電子染色。這里所謂電子染色是根本不同于光學顯微鏡的染色,它是利用重金屬鹽(如鉛鹽、鈾鹽等)與細胞的某些成分或結構結合,由于重金屬對電子散射能力很強,使那些與其結合的結構或成份對電子散射能力增強,從而達到提高樣品本身反差的。目前最常用的染色劑是醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液。操作流程是:超薄切片先檸檬酸鉛染色10分鐘,去二氧化碳的雙蒸水清洗3次,再用醋酸鈾染色30分鐘,雙蒸水清洗3次,等超薄切片干燥后,即可上透射電鏡觀察。