質譜沙龍第十五期活動報道

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質譜沙龍第十五期活動報道

2008.12.29

2008年12月21日下午，質譜沙龍第十五期活動在第二炮兵總醫院遠程會診中心會議室舉行。來自發酵研究院、清華大學、二炮總醫院、朝陽醫院、北大醫學院、北醫三院、安貞醫院、解放軍307醫院、中科院植物所、AB公司的各位專家、老師、學生20余人。

質譜在植物代謝組學中的應用

首先由中科院植物所的楊芬博士結合自己的研究課題，為大家做題為《質譜在植物代謝組學中的應用》。代謝組學是系統生物學的一個組成部分（注：基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學四個組學組成了系統生物學）。系統生物學是研究一個細胞、組織、器官內所有物質及其代謝物信息的科學。代謝組學最早是英國帝國理工學院的杰里米·尼科爾森教授提出的，從上個世紀80年代開始，他致力于研究大鼠血液、尿液的代謝物及其與疾病的關系，被譽為國際代謝組學之父。代謝組學主要是研究在新陳代謝動態的進程中代謝產物變化的規律，從而揭示機體、生命活動代謝本質的一門學科，其研究對象大都是相對分子質量1000以內的小分子物質。先進分析檢測技術結合模式識別和專家系統等計算分析方法是代謝組學研究的基本方法。

中科院植物所楊芬博士

代謝組學的研究主要分為三個部分：樣品制備、中期代謝產物的分離檢測鑒定、到最后數據分析與模型的建立。

代謝組學在植物領域應用也非常廣泛。比如：（1）它作為一個橋梁，將基因產物與基因關聯起來，從而實現基因功能的鑒定。比如植物中常使用的模式植物擬南芥，擬南芥中90％的突變體是“沉默”型的突變體，很難通過表現型的變化來確定有關基因的功能。轉基因的生物或者敲除某些基因的突變體中的代謝物的含量會發生變化，通過監測代謝產物的變化，把其與野生型區分開來，從而實現基因功能的鑒定。（2）可以推斷有關基因的功能。（3）能夠找到代表植物表型的一些標志性化合物，從而對植物的表型進行分類，比如Fiehn 研究組用GC/MS的工作，就發表在Nature上。

接著，楊芬博士介紹了其研究組在研究花生代謝組學方面的一些進展（正在研究，詳情不再介紹），主要為大家簡單介紹代謝組學的研究流程。去胚的花生被某種菌侵染（不產毒菌侵染的作為對照，另一個樣品為產毒菌侵染的）后，在28℃培養，進行不同的樣品提取步驟后，分別用GCMS和LCMS分析，得到代謝物的質譜，然后對數據進行預處理、多變量分析，比較1～7天的結果，最后找到標志性的化合物。在結果演示中，主要展示了LC/MS一級質譜和二級質譜的結果，比如她們通過對比后，發現了幾種標志物。

在數據處理中，主要用了儀器公司自帶的軟件（MarkLynx），公司的軟件將數據預處理和多變量分析整合在一起，給出結果；但公司的多變量分析軟件只能用PCA方式，而且看不到數據預處理的方式，最后她們的研究小組沒有采用。另一種處理方法利用了兩個免費軟件，MetaLAN進行數據預處理，并可清晰地看到數據預處理的過程，比如基線處理，兩組數據間的TIC圖比較。MetaLAN數據預處理后，將數據導入到另一個軟件進行分析，并可選取多變量分析的方法，比如最終選擇了PLS_DA的模型和結果。（注：PCA主成分分析；PLS偏最小二乘法；OPLS正交偏最小二乘法）

代謝組學目前存在的問題是：比如沒有一種分析手段可以對研究體系中所有的化合物進行代謝組學分析；樣品的變異；儀器的動態范圍局限性；代謝組學產生海量的數據，還要開發更多的信息學的工具。

研究的挑戰和未來的研究方向：如何把代謝組學的數據和其它三種組學的數據，以及代謝途徑、表現型數據分析的數據整合在一起，才能給出整個系統生物學中一些問題的解釋。

提問中，在座專家問了一些問題，楊博士一一給予解答。比如關于為什么要用氣質測定脂肪酸？這是因為農作物中，含高油脂的化合物更容易感染毒菌，比如花生的脂肪酸含量大約80％以上，用氣質聯用主要是看脂肪酸的含量、代謝是否和產毒有關。另外關于實驗的重復性，實驗至少要重復兩次；樣品量要有保證，真正在做植物代謝組學實驗中，得用6～8個樣品同時做。植物代謝組學的數據庫目前非常少，目前只可以獲得番茄的代謝組數據庫。用LC/MS/MS的二級譜圖與標準品對照，可以最終識別可能的代謝物。

生物標志物驗證的整體解決方案——MIDAS?技術流程

AB公司亞太應用支持中心的應用工程師郭立海為大家介紹了題為：《生物標志物驗證的整體解決方案——MIDAS?技術流程》的報告。

AB公司亞太應用支持中心的應用工程師郭立海

生物標志物的整個研發流程中，有四個階段：Discovery、Candidate Verification、Candidate Validation、Clinical Utilization。目前國內的生物標志物研究主要處于Discoery階段；而AB公司的這個報告，主要是想推動大家向下一階段邁進。在Discovery階段，樣本量比較少，找到的生物標志物可能不是真正的標志物，這時，除了要盡可能使用準確可靠的標志物發現技術比如iTRAQ試劑，還要進入標志物驗證的階段。在驗證階段，過去常用Western-blot，ELISA方法，但耗時耗力，不能做到規模化，而且需要抗體，沒有抗體或抗體不好制備時就無能為力，解決辦法是發展快速、準確的高通量技術方法，不需要抗體，只要知道需要驗證蛋白是什么。ABI推出的MIDAS流程正是為了解決這個問題。

MIDAS?技術（又叫 “MRM Triggered IDA”）結合了Qtrap質譜儀串聯四極桿的高選擇性的MRM掃描和線性離子阱高靈敏度的MS/MS掃描功能。MIDAS?流程的特點是：可以定向檢測低豐度的肽段或翻譯后修飾，既具有特異性，又具有高靈敏度；一次實驗中，用于檢測的MRM可以定量多個候選物，而用于確認鑒定的MS/MS掃描進行目標確認增加了MRM的可信度；可以直接用酶解樣品（如血液等）來建立MRM方法；方法建立很快：直接從發現到驗證；成本低：不需要合成肽段。

MIDAS Qtrap工作模式

關于為什么要用Qtrap，郭工舉了幾個例子：（1）在做MS/MS全掃描時，線性離子阱的靈敏度比串聯四極桿高100倍；（2）MRM可能會產生誤讀，比如一個肽段的MRM在預定的時間獲得了很高的信號強度，但MS/MS譜圖卻與假定的biomarker肽段匹配不好，數據庫檢索證明是豐量蛋白hemoglobin的肽段，而不是真正的Biomarker。

MIDAS的工作流程為：從文獻、蛋白質組或基因組的數據，將蛋白酶解后產生理論的肽段，根據理論預測進行MRM相對定量，同時用MS/MS鑒定。工作流程如圖：

MIDAS?的工作流程示意圖

同時，ABI還提供了多個實現MIDAS?的軟件：

MIDAS? Workflow Designer：根據肽碎裂規律，利用蛋白序列自動生成MRM離子對，并創建IDA方法
MRMPilot? Software：利用蛋白序列或實際MS/MS數據自動生成MRM離子對，并創建IDA方法
MultiQuant? Software：對MRM數據進行分析，可進行相對和精確定量
Scheduled MRM：根據保留時間最大程度地提高分析物數目，從而提高MRM效率（第十四期質譜沙龍曾介紹）

郭工還介紹了在生物標志物的驗證階段，實現MIDAS實驗良好重復性的試劑：mTRAQ?試劑，它是一種定量的內標，實現歸一化，提高定量實驗的重復性和一致性。其特點為：

是一種非同重同位素標簽，基于iTRAQ?試劑發展而來（iTRAQ試劑是同重標簽），標記原理、方法和效率相同，實現了生物標志物發現和驗證兩個階段的無縫鏈接
在MS或MS/MS，輕、重標記都有4amu的質量差異，這一點與iTRAQ試劑不同
可以針對高質量碎片離子設計特定的MRM離子對：提高了特異性、降低了噪音（LC/MS的高質量端噪音較低）
MRM的輕、重標記的離子對在Q1和Q3的質量數都是不同的
輕、重標記的肽段在色譜上表現為共洗脫

mTRAQ試劑示意圖

郭工舉例顯示了模擬真實條件下的、不利用自動進樣器的uL級進樣中，在引入內標后，蛋白定量的重復性得到了提高（大部分肽段的定量CV值從15～30％，降低到<10%）；而如果對每個蛋白取幾個肽段，結果再對肽段做平均，可以進一步提高定量的重復性（有更多的肽段定量實驗CV值<10%）。

因此，在生物標志物鑒定中，ABI提供多種解決方案：在Discovery階段，可用4800 Plus TOF/TOF或QStar結合iTRAQ試劑、ProteinPilot軟件；在驗證階段，均可以使用4000 QTap、mTRAQ試劑和一些應用軟件。

郭工講畢，大家對新技術表現出濃厚熱情，尤其是前幾期沙龍中，曾介紹過用iTRAQ進行氨基酸定量的技術，大家比較關注技術的區別。郭工再次為大家區分了iTRAQ和mTRAQ試劑：兩者都是同位素標記的試劑，iTRAQ是等重的，即在一級質譜中被標記的幾種物質是一樣的，在二級質譜中得以區分；而mTRAQ是非等重的，被標記的物質在一級質譜、二級質譜中的分子量都會不同，同時，mTRAQ加大了質量差至4 amu，所以特異性、準確度會更高。當然，在驗證階段，用一對（兩個）標記就可以了，它是作為內標，用于定量的是MRM離子對；在Discovery階段，現在的iTRAQ試劑常會比較2～8個樣本，所以，iTRAQ標志物的離子對會存在2～8個，用于定量的是全掃描狀態下的二級碎片離子（如113、114、115、116、117、118、119、121等）

報告下載：生物標志物驗證的整體解決方案——MIDAS?技術流程

最后，由李鵬飛老師主持，討論了一些液質聯用使用過程中的常見問題。大家討論了明年質譜沙龍的一些活動計劃，比如仍然將側重于液質聯用，藥物等小分子研究，但也會增加氣質聯用、蛋白等大分子研究的討論。