ZIC-HILIC 法鑒定"皮革奶"
不法商家將皮革下腳料混入牛奶，用于提高蛋白質含量，稱為“皮革奶”。因在皮革水解蛋白的生產過程中往往添加有重鉻酸鉀、重鉻酸鈉等化學物質，鉻在后續處理過程中無法完全除去，如果長期食用添加了皮革水解蛋白的“皮革奶”，金屬鉻會被人體吸收，積累于骨骼之中，長期積累便會中毒，使人體關節疏松腫大，甚至造成兒童死亡。L- 羥脯氨酸(L-HYP)是動物水解蛋白中特異的成分，其含量占動物水解蛋白的10%以上，而乳蛋白中不含此成分，因此可以通過檢測乳制品中L-羥脯氨酸的含量來判斷是否添加了動物水解蛋白。
本文采用ZIC?-HILIC 色譜柱，建立了LC-MS/MS 方法用于監測“皮革奶”。兩性離子- 親水作用液相色譜(ZIC-HILIC)是在硅膠或聚合物表面鍵合了一個磺基甜菜堿結構的兩性離子鍵合相。固定相表面會建立一個富集水的液體層，分析物在流動相和該水層之間進行分配，這是HILIC 中親水分配的初級保留作用，在這個過程中，水層作為固定相的一部分參與分配。同時，這種固定相表面的離子能夠與不同類型的離子型化合物產生靜電作用，靜電作用增加了親水固定相的選擇性。不過，如果化合物與固定相的靜電作用太強，化合物不易洗脫，則需要采用高濃度的緩沖鹽來調節，這樣會抑制質譜信號，降低靈敏度。在兩性離子固定相中，每個電荷的靜電作用都會被鄰近的反向電荷部分地平衡或抵消，因此，總的靜電作用是比較弱的。較弱的靜電作用允許流動相使用較低的緩沖鹽濃度，這對提高質譜檢測器的檢測靈敏度是有利的。
儀器及試劑
色譜柱ZIC?-HILIC，PEEK HPLC Column 150×2.1 mm，5 μm，200 ?(默克密理博);Milli-Q Advantage 超純水系統(默克密理博);液質聯用儀Agilent1200-API 3200(AB Sciex)。
色譜用乙腈為LichroSolv? 梯度級別，乙酸銨、乙酸、鹽酸、氫氧化鈉等分析試劑均為EMSURE? 級(默克)。
實驗方法
樣品處理
取牛奶2.0 g，加10.6 mol/L 鹽酸溶液6 ml，真空封管，于110 ℃下水解12 h。揮干溶劑，加水溶解，NaOH 溶液(1M/L)調節至中性，加水定容至25 ml。轉入50 ml 離心管中，8000r/min 離心3 min，上清液用50 mmol/L 乙酸銨水溶液+ 乙腈(2+8)混合溶液稀釋10 倍，過0.45 μm 微孔濾膜，濾液直接進高效液相色譜/ 串聯質譜儀檢測。
圖1. L- 羥脯氨酸對照品（濃度為500μg/L）的典型色譜圖（選擇離子m/z:132，68，86）
圖2. 牛奶樣品加標（L- 羥脯氨酸800 ppb）典型色譜圖（選擇離子m/z:132，68，86）。
圖3. 校準曲線。
測試條件
色譜條件：流動相(v/v)，A 為醋酸銨(50 mM，pH 5.6)，B 為乙腈;梯度：0 ~10 min 85 % ~ 85 % B，10 ~ 12 min 85 % ~55 % B，15~ 20min 55% ~ 55 % B;流速: 0.8 ml/min;進樣量：2 μl ;柱溫：25 ℃。
質譜條件：離子源，電噴霧離子源;掃描方式，正離子掃描;電噴霧電壓(V)，5500;離子源溫度(℃)，600;氣簾氣壓力(Pa)，20 ;霧化氣壓力(Pa)，50 ;輔助氣壓力(Pa)，30 ;碰撞能量分別為22 和18V ;檢測方式，多反應檢測(MRM)，母離子(m/z)132.1，選擇離子(m/z)86.0 和68.2。
圖4. 某品牌牛奶樣品的典型色譜圖（選擇離子m/z:132，68，86）
圖5. 膠原蛋白樣品的典型色譜圖（選擇離子m/z:132，68，86）。
結果與討論
流動相及定量離子的選擇
典型的HILIC 流動相需在水或揮發性緩沖液中含有40 % ~ 95 % 的乙腈。為獲得好的分離重現性，流動相應至少保持3 % 的水，以確保固定相顆粒被充分地潤濕。由于HILIC是一種在反相條件下進行的正相分離模式，因此增加流動相中的有機溶劑會提高溶質的保留時間，相反，提高流動相中水的比例，則會降低被分析物的保留時間。
為了改善化合物在親水作用色譜中的分離效果，通常選用醋酸銨或甲酸銨作為緩沖鹽添加到流動相中，乙酸、甲酸可以用來調節流動相的pH 值。磷酸鹽也可以作為緩沖鹽，但必須注意小心使用，避免有機相析出堵塞色譜柱甚至損壞儀器。使用85：15 的乙腈/ 水(pH=5.6)為流動相，流速為0.8 ml/min，L-羥脯氨酸對照品、空白牛奶樣品加標的典型圖譜見圖1、圖2。
在優化的色譜- 質譜條件下，m/z 132 為羥脯氨酸的準分子離子[M+H]+，m/z 86 和/m/z 68 為L- 羥脯氨酸的特征離子碎片。可采用特征的子離子與其他相同分子量的氨基酸(如亮氨酸)進行區分。本實驗采用子離子m/z 86 進行定量。
表1. 精密度及回收率
線性關系、檢測限和定量限
配制一些L- 羥脯氨酸對照品，在選定的色譜- 質譜條件下分別進樣測試，根據子離子m/z 86 的峰面積與樣品濃度，繪制校準曲線，結果見圖3。由圖3 可見，在20 ~ 1000 μg/L 范圍內，標樣濃度與峰面積呈良好的線性關系，線性方程為Y = 476.87X + 5379.3，R2 =0.9998。將L- 羥脯氨酸逐級稀釋，方法最低檢出限10 ng/L(S/N=3)，定量限30 ng/L(S/N=10)。在牛奶樣品中添加與最低檢出限相當濃度的一系列標樣，來驗證方法的靈敏度，本方法在實際樣品中的最低檢測限為1.25 mg/kg，定量限為4.2 mg/kg。
重現性及加標回收實驗
在純牛奶樣品(羥脯氨酸未檢出)中加入羥脯氨酸標樣，經樣品處理處理后，以選定的方法測定，結果見表1，可以看出，方法的精密度良好(RSD<3%)，加標回收率89 % ~ 94 %，方法準確可靠。
樣品分析
分別稱取0.2g 某品牌牛奶樣品、豬皮膠原蛋白各3 份，檢測得到典型圖譜見圖4，圖5。在牛奶樣品中未檢出L- 羥脯氨酸，說明該牛奶樣品中未添加“皮革奶”。豬皮膠原蛋白樣品中L- 羥脯氨酸檢測含量為14.12 %，結果與膠原蛋白中的羥脯氨酸實際含量一致。
