微生物實驗室--培養基適用性操作規程
一、目的：
建立培養基適用性檢查操作規程，保證培養基的質量，確保檢驗結果的準確性。
二、適用范圍：
本規程規定了培養基適用性檢查方法和操作要求，適用于微生物實驗室計數用培養基、控制菌檢查用培養基的適用性檢查。
三、內容：
1、簡述
1.1 培養基適用性檢查試驗可用于確定實驗室所使用培養基(包括購置的不同批號的成品培養基、不同批號的脫水培養基、按處方自行配制培養基所用不同批次的原材料等)、制備程序（包括水質控制、配制方法、滅菌程序等）、保存條件（溫度、濕度、時間及盛裝培養基的容器條件等）等是否滿足微生物限度檢查要求。
1.2 計數用培養基適用性檢查包括需氧菌、霉菌及酵母菌總數計數。
1.3 控制菌檢查用培養基適用性檢查包括促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查。
2 計數用培養基適用性檢查
微生物限度檢查中計數用培養基有5種，胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、R2A瓊脂培養基、平板計數培養基。
2.1 培養基及配制
2.1.1 培養基：胰酪大豆胨瓊脂培養基、胰酪大豆胨瓊脂對照培養基；沙氏葡萄糖瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養基；R2A瓊脂培養基、R2A瓊脂對照培養基；平板計數培養基。
2.1.2 配制：照《培養基配制標準操作規程》配制。
2.2 試劑及稀釋劑配制
2.2.1 試劑：pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、聚山梨酯80、氯化鈉。
2.2.2 稀釋劑配制
? pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液：稱取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液14.63g,加水1000mL溶解，分裝，滅菌（121℃、15min）。
? 0.05％（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液：取已經滅菌好的聚山梨酯80（1mL），加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，搖勻，即得。
? 0.9％無菌氯化鈉溶液：稱取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000mL，分裝，滅菌（121℃、15min）。
3 試劑及消毒液配制
3.1 試劑
新潔爾滅溶液、84消毒液、苯酚、75％醫用消毒酒精。
3.2 消毒液配制
3.2.1 84消毒液：取84消毒液1ml，加水60ml(1：60)，搖勻即得。
3.2.2 0.1％新潔爾滅溶液：取新潔爾滅溶液20.4ml，加水至1000ml，搖勻，即得。
3.2.3 5％的苯酚溶液：稱取苯酚5g，加水至100ml,搖勻，即得。
3.2.4 75％酒精棉球：取滅菌脫脂棉撕成小塊并揉捏成團，置于廣口瓶內，加入75% 醫用消毒酒精，充分浸潤，即得。
4 試驗用菌株及菌液制備
4.1 試驗用菌株
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003］
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC(B)10104］
枯草芽孢桿菌（Bacillus s aureus）［CMCC(B)63501］
白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC(F)98001］
黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC(F)98003］
4.2 菌液制備
4.2.1 儀器與用具
? 儀器：生化培養箱（30～35℃）、霉菌培養箱（20～25℃）、恒溫水浴鍋。
?用具：酒精燈、打火機、吸耳球、試管架、大試管（20×200mm、15×200mm）、錐形瓶、硅膠塞、刻度吸管（1mL、2mL、5mL/10mL）、吸管桶、接種環、培養皿（90mm）、不銹鋼培養皿桶、不銹鋼吸管桶、玻璃專用筆。
5 菌液制備方法
5.1 金黃色葡萄球菌菌液制備方法
5.1.1 用無菌接種取金黃色葡萄球菌斜面中底部菌落一環，在裝有pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL的試管內壁上輕輕摩擦，使環上的菌苔全部洗于溶液中，振搖混勻。
5.1.2 用1ml無菌吸管吸取上述均勻菌液0.1mL加入裝有9.9mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中，混勻，作為10-1級。
5.1.3 以此類推，10倍遞增稀釋至每1ml含菌數不大于100cfu的菌懸液，備用。
5.2 枯草芽孢桿菌菌液制備方法
照金黃色葡萄球菌菌液制備方法同法操作。
5.3銅綠假單胞菌菌液制備方法
照金黃色葡萄球菌菌液制備方法同法操作。
5.4 白色念珠菌菌液制備方法。
5.4.1 用無菌接種取白色念珠菌斜面中底部菌落一環，在裝有pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml的試管內壁上輕輕摩擦，使環上的菌苔全部洗于溶液中，振搖混勻。
5.4.2 用1ml無菌吸管吸取上述均勻菌液0.1ml加入裝有9.9ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中，混勻，作為10-1級。
5.4.3 以此類推，10倍遞增稀釋至每1ml含菌數不大于100cfu的菌懸液，備用。
5.5 黑曲霉液制備方法
5.5.1 取黑曲霉的斜面一支，加入20ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液于上述斜面培養物中，將孢子洗脫。
5.5.2 用管口帶有薄的無菌棉花的無菌吸管吸出全部孢子懸液，裝入另外一支無菌試管中，混勻，作為原液。
5.5.3 用1ml無菌吸管從試管中吸取0.1ml至另一支裝有9.9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中，混勻，作為10-1級。
5.5.4 以此類推，10倍遞增稀釋至每1ml含菌數不大于100cfu的孢子懸液，備用。
5.6 注意事項
5.6.1 每一稀釋級，均需制備2個菌數計數平皿。（每一稀釋級取2個無菌平皿，每皿接種1ml菌液，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，凝固后于30～35℃培養箱培養18～24h，計數；白色念珠菌、黑曲霉傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，混勻，凝固后于20～25℃培養箱培養96h，計數。
5.6.2 每遞增一稀釋級，必須另換一支吸管。
5.6.3 稀釋時，吸管插入上一級試管內不低于液面2.5cm，反復吸吹數次。
5.6.4 吸液時，應先吸至高于吸管刻度上部少許，然后提起吸管，貼于試管內壁調整液量至刻度，吸管移至下一稀釋試管的內壁近液面處（切勿接觸液面）緩慢地放出全部試液。
5.6.5 所用稀釋菌液吸管均需放入裝有5％苯酚溶液的消毒缸內，24小時后才能洗滌。
5.6.6 菌懸液制備后，若在室溫下放置應在2h內使用，若在2～8℃冰箱保存的菌懸液可以在24h內使用。黑曲霉孢子懸液可在2～8℃冰箱保存，在驗證過的貯存期內使用。
6 計數用培養基的適用性檢查
6.1 實驗操作
6.1.1 胰酪大豆胨瓊脂培養基
? 接種方法
分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液于無菌平皿中，傾注約20ml胰酪大豆胨瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，輕輕搖勻。用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述實驗。
? 適用性檢查
將接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養皿、對照培養皿于30～35℃培養不超過3天；將接種白色念珠菌、黑曲霉的培養皿、對照培養皿于20～25℃培養不超過5天。
6.1.2 沙氏葡萄糖瓊脂培養基
? 接種方法
分別接種不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液于無菌平皿中，傾注約20ml沙氏葡萄糖瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，輕輕搖勻。用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述實驗。
? 適用性檢查
將接種白色念珠菌、黑曲霉培養皿、對照培養皿于20～25℃培養不大于5天。
6.1.3 R2A瓊脂培養基
? 接種方法
分別接種不大于100cfu的銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液于無菌平皿中，傾注約20mlR2A瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，輕輕搖勻。用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述實驗。
? 適用性檢查
將接種銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養皿、對照培養皿于30～35℃培養不大于3天。
6.1.5 平板計數瓊脂培養基
? 接種方法
分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液于無菌平皿中，傾注約15ml該培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，輕輕搖勻。用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述實驗。
? 適用性檢查
將接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養皿、對照培養皿于30～35℃培養不超過3天；將接種白色念珠菌、黑曲霉的培養皿、對照培養皿于30～35℃培養不超過5天
6.2 觀察與計算
? 觀察被檢培養基上銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落形態、大小與對照培養基上銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落形態、大小是否一致。
? 依次計算被檢培養基上銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落平均數與對照培養基上銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿、白色念珠菌、黑曲霉的菌落平均數的比值。
6.3 結果與判斷
? 若被檢固體上的菌落數平均數與對照培養基菌落數平均數的比值應在0.5～2范圍內，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致，各菌適用性檢查符合規定。
? 若被檢固體上的菌落數平均數與對照培養基菌落數平均數的比值低于0.5～2范圍，且菌落形態大小與對照培養基上的菌落不一致，則判斷該培養基的適用性查不符合規定。
7 控制菌檢查用培養基適用性檢查
控制菌檢查用培養基有液體培養基和固體培養基。
7.1 培養基及制備
? 培養基：脫水培養基、對照用培養基。
? 制備：照培養基配制規程新鮮配制。
7.2 試驗用菌株及菌液制備
? 試驗用菌株
大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC(B)44102］
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003］
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCCB(B)63501]
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC(B)10104］
沙門菌（Salmonella paratyphi B）［CMCC(B)50094］
白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC(F)98001］
7.3 控制菌檢查用培養基需要測試的能力及判斷指標
7.3.1 液體培養基
? 促生長能力檢查
取不大于100CFU的試驗菌分別接種于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度（30～35℃）或（42～44℃）及最短培養基時間下培養。與對照培養基比較，被檢培養基中試驗菌應生長良好，表現為液體培養基變渾濁。
? 指示特性檢查
取不大于100CFU的試驗菌分別接種于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度（30～35℃）或（42～44℃）及最短培養基時間下培養。與對照培養基管比較，被檢培養基中試驗菌生長情況/指示劑反映情況應與對照培養基一致。
? 抑制能力檢查
取不大于100CFU的試驗菌分別接種于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度（30～35℃）或（42～44℃）及最長培養基時間下培養，試驗菌應不得生長。
7.3.2 固體培養基
? 促生長能力檢查
取試驗菌液（含菌數不大于100CFU）分別接種于被檢培養基和對照培養基上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度（30～35℃或（42～44℃））及最短培養基時間下培養。與對照培養基比較，被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態特征應一致。
? 指示特性檢查
取試驗菌液（含菌數不大于100CFU）分別接種于被檢培養基和對照培養基上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度（30～35℃）或（42～44℃）及最短培養基時間下培養。被檢培養基上試驗菌的菌落形態特征、菌落顏色及指示劑反應情況應與對照培養基一致。
? 抑制能力檢查
取試驗菌液（含菌數不少于100CFU）分別接種于被檢培養基和對照培養基上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度（30～35℃）或（42～44℃）及最長培養基時間下培養，試驗菌應不得生長。
7.4 培養基能力測試列表
控制菌檢查用培養基適用性檢查項目、菌株及判斷指標
| 培養基 | 測試菌株 | 測試特性 | 測試指標 |
| 胰酪大豆胨液體培養基 | 銅綠假單胞菌 | 促生長能力 | 渾濁 |
| 金黃色葡萄球菌 | 促生長能力 | 渾濁 | |
| 枯草芽孢桿菌 | 促生長能力 | 渾濁 | |
| 沙氏葡萄糖液體培養基 | 白色念珠菌 | 促生長能力 | 渾濁 |
| RV沙門菌增菌液體培養基 | 沙門菌 | 促生長能力 | 渾濁 |
| 金黃色葡萄球菌 | 抑制能力 | 不得生長 | |
| 麥康凱液體培養基 | 大腸埃希菌 | 促生長能力 | 渾濁 |
| 金黃色葡萄球菌 | 抑制能力 | 不得生長 | |
| 麥康凱瓊脂培養基 | 大腸埃希菌 | 促生長能力+指示特性 | 大小顏色形態同對照 |
| 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基 | 沙門菌 | 促生長能力+指示能力 | 大小顏色形態同對照 |
| 三糖鐵瓊脂培養基 | 沙門菌 | 指示能力 | 大小顏色形態、指示劑反應同對照 |
| 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基 | 金黃色葡萄球菌 | 促生長能力+指示特性 | 大小顏色形態同對照 |
| 大腸埃希菌 | 抑制能力 | 不得生長 | |
| 溴化十六烷基三甲銨瓊脂 | 銅綠假單胞菌 | 促生長能力 | 大小顏色形態同對照 |
| 大腸埃希菌 | 抑制能力 | 不得生長 | |
| 腸道增菌液體培養基 | 大腸埃希菌 | 促生長能力 | 渾濁 |
| 銅綠假單胞菌 | 促生長能力 | 渾濁 | |
| 金黃色葡萄球菌 | 抑制能力 | 不得生長 | |
| 念珠菌顯色培養基 | 白色念珠菌 | 促生長能力+指示能力 | 大小顏色形態、指示劑同對照 |
| 大腸埃希菌 | 抑制能力 | 不得生長 | |
| MUG培養基 | 大腸埃希菌 | 促生長能力+指示能力 | 大小顏色形態、指示劑同對照 |
7.5 實驗操作
7.5.1 胰酪大豆胨液體培養基
? 促生長能力檢查
接種方法：分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液于該培養基中，接種量不大于100cfu，搖勻，培養。用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述實驗。
? 適用性檢查：30～35℃培養不超過3天。
7.5.2 沙氏葡萄糖液體培養基
? 促生長能力檢查
接種方法：接種白色念珠菌于該培養基中，接種量不大于100cfu，搖勻，培養。用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述實驗。
? 適用性檢查：20～25℃培養不超過3天。
7.5.3 RV沙門菌增菌液體培養基
? 促生長能力檢查
接種方法：分別接種不大于100cfu的沙門菌于被檢培養基和對照培養基中。
適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，與對照培養基管比較。
? 抑制能力檢查
接種方法：分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌于被檢培養基和對照培養基中。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，并將被檢培養基與對照培養基管
比較。
7.5.4 麥康凱液體培養基適用性檢查
? 促生長能力檢查
接種方法：分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養基和對照培養基中。
適用性檢查：在42～44℃條件下培養18～24h，與對照培養基管比較。
? 抑制能力檢查
接種方法：分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌于被檢培養基和對照培養基
中。
? 適用性檢查：在42～44℃條件下培養24h，并將被檢培養基與對照培養基管比較。
7.5.5 麥康凱瓊脂培養基適用性檢查
? 促生長能力+指示特性的檢查
接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養基和對照培養基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h。
7.5.6 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基
? 促生長能力+指示特性的檢查
接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的沙門菌于被檢培養基和對照培養基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h。
7.5.7 三糖鐵瓊脂培養基、
? 指示能力
接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的沙門菌于被檢培養基和對照培養基高層斜面上，便進行穿刺。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h。
7.5.8 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基
? 促生長能力+指示特性的檢查
接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌于被檢培養基和對照培養基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h。
? 抑制能力檢查
接種方法：用涂布法分別接種不少于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養基和對照培養基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，并將被檢培養基與對照培養基比較。
7.5.9 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基
? 促生長能力檢查
接種方法：用涂布法接種不大于100cfu的銅綠假單胞菌于被檢培養基和對照培養
基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，與對照培養基比較。
? 抑制能力檢查
接種方法：用涂布法分別接種不少于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養基和對照培養基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，并將被檢培養基與對照培養基比較。
7.5.10 腸道菌增菌液體培養
? 促生長能力檢查
接種方法：分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌于被檢培養基和對照培養基中。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，與對照培養基管比較。
? 抑制能力檢查
接種方法：分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌于被檢培養基和對照培養基中。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，并將被檢培養基與對照培養基管比較。
7.5.12 平板計數瓊脂培養基
? 促生長能力檢查
接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養基和對照培
養基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，并將被檢培養基與對照培養基比較。
? 抑制能力檢查
接種方法：用涂布法分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌于被檢培養基和對照培養基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，并將被檢培養基對照培養基比較。
7.5.13 念珠菌顯色培養基
? 促生長能力檢查
接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養基和對照培
養基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，并將被檢培養基與對照培養基比較。
? 抑制能力檢查
接種方法：用涂布法分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌于被檢培養基和對照培養基平板上。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h，并將被檢培養基對照培養基比較。
7.5.14 MUG培養基
? 促生長能力+指示特性的檢查
接種方法：分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養基和對照培養基平板中。
? 適用性檢查：在30～35℃條件下培養18～24h。
8 注意事項
8.1 培養基的配制方法和滅菌程序發生變更時，應再次對培養基進行適用性檢查。
8.2 培養基批號發生變更時，應再次對培養基進行適用性檢查。
8.3 培養基供應商發生變更時，應再次對培養基進行適用性檢查。
9 記錄
每一次進行培養基的適用性檢查后在《培養基適應性驗證記錄》上記錄。
