細菌內毒素檢驗（二）
4.3.3.2漩渦混合器
作用：混旋細菌內毒素
標準品，保證標準品溶液
的濃度一致。
方式：
對凍干粉的細菌內毒素標準品復溶后，應混旋15min。
標準品梯度稀釋過程中，每步稀釋應混旋30s.
4.3.3.3試管恒溫儀：
作用：提供37℃恒溫的環境。
方式：
對加入了內容物的鱟試劑分別放置于試管恒溫儀中，37℃恒溫60min±2min溫育培養后，觀察結果。
4.3.4試劑：
細菌內毒素標準品：工作標準品、國家標準品
鱟試劑：利用鱟血液中的變性細胞，經裂解液和機械方式促使細胞破裂而提取到的一種細胞溶解物，能與極微量的細菌內毒素形成特異凝膠反應，反應的速度和凝膠的堅固程度與內毒素濃度有關，是體外檢測內毒素的敏感試劑。
細菌內毒素檢查用水：含細菌內毒素的量極低：<0.015EU/ml ，不引入細菌內毒素，對內毒素試驗無干擾作用。
4.3.5試驗過程：
在進行日常檢驗前，需要進行鱟試劑靈敏度復核和供試品干擾試驗，確定鱟試劑的標示靈敏度的準確性和供試品的最大有效稀釋倍數、最小稀釋倍數。
靈敏度復核試驗：
每批鱟試劑用于檢測前都必須進行靈敏度復核。
試驗舉例： 內毒素工作標準品為100EU/支；
待測鱟試劑靈敏度λ＝0.25EU/ml。
1）制備內毒素標準溶液：取工作標準品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用75％酒精擦拭后啟開，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min后進行稀釋，步驟如下：
2）溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml裝量，則取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鱟試劑裝量大于0.1ml，則取若干支，按標示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分裝于標準玻璃試管（10mm×75mm），將試管按如下形狀排列。
3）加樣：每列每支加入相應濃度的內毒素標準品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。
反應及結果判斷：加樣結束后用封口膜封口，輕振動混勻，置37 ℃水浴中保溫60±2min，將每管拿出緩緩倒轉180°，凝膠不變形為“＋”，凝膠不能保持完整為“－”。
當2.0λ四支管都為陽性，0.25λ四支管都為陰性時，試驗成立，按下面底公式計算復核的靈敏度λc ：
λc＝lg-1(∑X/4)
（X:反應終點濃度的對數值。）
當0. 5λ≤λc ≤2.0λ時，鱟試劑靈敏度復核合格，檢測時仍以標示靈敏度λ為準。
樣品的干擾試驗
注：當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。（注：須三個批號以上的供試品，兩個以上鱟試劑廠家的試劑）
當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。如：內毒素檢查時，供試品陽性對照為陰性時。方法為通過比較鱟試劑與在水溶液中的內毒素和供試品溶液中的內毒素反應的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對內毒素檢查有干擾。
操作：用內毒素檢查用水和供試品將同一支內毒素標準品分別制備一系列濃度的內毒素溶液，詳見下表：
|
編 號 |
內毒素濃度/配制內毒素的溶劑 |
稀釋用液 |
稀釋倍數 |
所含內毒素 的濃度 |
平行管數 |
|
A |
無/供試品溶液 |
－ |
－ |
－ |
2 |
|
B |
2λ/供試品溶液 |
供試品溶液 |
1 |
2λ |
4 |
|
2 |
1λ |
4 |
|||
|
4 |
0.5λ |
4 |
|||
|
8 |
0.25λ |
4 |
|||
|
C |
2λ/檢查用水 |
檢查用水 |
1 |
2λ |
4 |
|
2 |
1λ |
4 |
|||
|
4 |
0.5λ |
4 |
|||
|
8 |
0.25λ |
4 |
|||
|
D |
無/檢查用水 |
－ |
－ |
－ |
2 |
|
A：供試品溶液 B：供試品陽性對照 C：陽性對照 D：陰性對照 |
結果判定：
當供試品陰性對照A和陰性對照D都為陰性，并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度范圍內時，試驗方為有效。
分別計算用檢查用水制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液和稀釋液制成的內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Et）；
ES =lg-1(ΣXS/4) Et =lg-1(ΣXt/4)
當ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～
2 ES（包括0.5 ES和2 ES）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。
導致干擾的因素及解決方案：
|
導致干擾的因素： |
排除干擾的方法： |
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pH值 |
稀釋 |
|
抗凝因子 |
中和 |
|
螯合劑 |
過濾 |
|
葡聚糖 |
加熱 |
4.3.5.3樣品的細菌內毒素檢驗
細菌內毒素限值L的確定
藥品、生物制品的細菌內毒素限值（L）除藥典有規定的，一般按以下公式確定： L＝K／M
K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K= 5EU/(kg·h)，放射性藥品注射劑K= 2.5EU/(kg·h)，鞘內用注射劑K= 0.2EU/(kg·h)；
M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、 mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均體重按60kg計算，人體表面積按1.62㎡計算。注射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉換為每千克體重劑量（M）
按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨床用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。
限值確認時要遵循從嚴原則，要考慮病人在疾病狀態的耐受力和可能存在的聯合用藥的情況。
2）供試品最大有效稀釋倍數的計算：
C·L
MVD＝
λ
λ：測試用鱟試劑靈敏度標示值(EU/ml)。
L：供試品細菌內毒素限值。
C：供試品濃度或供試品復溶后所得樣品濃度。
當L單位為EU/ml（溶液）時，C的單位為1ml/ml；
當L單位為EU/mg或者EU/u時（抗生素原料），C的單位為mg/ml或者u/ml。
3）供試品溶液稀釋：將供試品稀釋，稀釋倍數為MVD。
含2λ內毒素標準品的供試品溶液（PPC）的制備：
4）加樣：取鱟試劑8支，每支加入BET水0.1ml溶解。2支為樣品管，加入樣品液0.1ml；2支加入陰性對照管，加入BET水0.1ml；2支為陽性對照管，加入2 2λ濃度的內毒素標準品溶液0.1ml；2支為樣品陽性管，加入0.1ml含2λ內毒素標準品的樣品溶液。
37±1℃水浴中保溫60±1min。
結果判斷：
陽性對照為陽性
陰性對照為陰性 試驗結果成立
樣品陽性對照為陽性
2支樣品管均為陰性時，樣品符合規定；
2支樣品管均為陽性時，樣品不符合規定；
樣品管1支為陽性1支為陰性時，需復試。
復試時做4支樣品管，有1支為陽性則樣品不符合規定。
|
結果判斷 |
樣品管 |
陰性對照 |
陽性對照 |
樣品陽性對照 |
|
符合規定 |
－－ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
|
不符合規定 |
＋＋ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
|
需復試 |
＋－ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
|
復試符合規定 |
－－－－ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
|
復試不符合規定 |
＋－－－ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
4.3.6內毒素檢驗的注意事項
1)溶解鱟試劑及混勻供試品和鱟試劑時，不要劇烈振蕩避免產生氣泡。
2)由于凝集反應是不可逆的，所以在反應過程中及觀察結果時應注意不要使試管受到振動，以免使凝膠破碎產生假陰性結果。
3)在進行鱟試劑靈敏度復核、干擾實驗和供試品細菌內毒素檢查時，各個實驗中要求的對照應同時進行，并在實驗有效的情況下才能進行計算和判斷。
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綜述
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標準
