樣本前處理方式
進樣器堵了，離子源臟了，柱壓又高了！每次遇到這種問題打電話給工程師，總要接受靈魂拷問：你用什么樣本做的？前處理方法是什么？Blabla一番后，最后的結論總是你的樣本太臟了，再優化下前處理吧！
臨床生化檢驗常用的生物樣本包括血清、血漿、尿液、唾液和各種組織等，這類樣本含有大量的蛋白質，無機鹽和磷脂等雜質。對于質譜分析來說，這類樣本都是比較 “臟”的，在進行分析前需要進行前處理除去雜質以保證質譜分析的靈敏度和獲得高準確度的結果。
生物樣本前處理又稱為樣本凈化，樣本制備等，主要是指將一個或多個待測目標分析物從復雜的生物基質中有選擇性地分離提取出來并使其達到一定水平的分析濃度，以滿足和適應儀器的分析和檢測要求。在臨床質譜分析中，樣本前處理占整體分析時間的60%左右。
生物樣本前處理的目的是：
凈化樣本（去除蛋白，磷脂和無機鹽等內源性雜質），富集待測目標組分；
減少基質效應，提高靈敏度；
保護進樣系統和色譜柱；
簡化分析過程和提高檢測通量。
帶來嚴重的殘留效應、磷脂堆積，離子抑制以及信號相應差；
前處理效果差，會增加樣本分析和儀器維護的成本；
影響實驗的重現性及色譜柱的壽命
常用的生物樣本前處理技術有蛋白沉淀法，液液萃取法，固相萃取法以及衍生化法等。
●蛋白沉淀法（PPT）●
在正常情況下，由于水化層和表面兩性電荷存在，在溶液中的蛋白質是穩定的分散體系，不會凝集。通過改變溶液的環境（改變pH值，介電常數和離子強度等），使蛋白質變性，降低其溶解度，最終使蛋白質凝聚而從溶液中析出。
常用的蛋白沉淀法有以下幾種：
鹽析法：在樣本溶液中加入中性鹽（常用硫酸銨），降低蛋白質溶解度，最終凝集而從溶液中析出。該方法是可逆的，析出的蛋白質經稀釋后仍具有生理活性。
有機溶劑沉淀法：生物樣本處理常用的方法之一。通過加入有機試劑（如甲醇、乙腈、乙醇、丙酮等），降低水溶液的介電常數，增加蛋白質間兩個相反電荷基團的吸引力，促進蛋白質分子的聚集和沉淀。另外，有機試劑可使蛋白質脫水，在水中的溶解度降低而析出。該方法需使用2-4倍樣本體積的有機溶劑才能達到較好的凈化效果。
加入變性試劑：改變溶液的pH值，使蛋白質等電點改變而析出。常用的變性劑有銅鹽、鋅鹽、三氯醋酸、焦磷酸等。
（Liquid-Liquid Extraction，LLE）
利用待測目標物在兩種不混溶的液體之間的溶解度或分配比不同，將其從一相中提取至另一相的溶劑中而實現分離的目的。LLE通常一相為水相，另一相則是有機溶劑，親水性化合物傾向溶于極性強的水相，而疏水化合物則傾向溶于有機溶劑中。該方法可以較好地去除干擾物質和純化待測目標物。通過氮吹，冷凍干燥等方式可以輕松濃縮待測目標物。
（Supported liquid extraction，SLE）
采用高比表面積的化學惰性物質（使用分級硅藻土）固定。當含水量高的生物體液樣本上樣后，樣本被吸附于硅藻土的微孔結構內， 在硅藻土微孔的表面形成一層薄薄的液膜。當加入與水不互溶的洗脫溶劑后，洗脫溶劑進入微孔內， 與水相液膜間進行微觀液液萃取，待測物被洗脫溶劑萃取出來，而磷脂、蛋白等雜質則會吸附在硅藻土的極性表面上，從而達到萃取-凈化效果。
●固相萃取●
（Solidphaseextraction，SPE）
基本原理與液相色譜相似。根據待測化合物和雜質在SPE柱上的分配系數不同，通過加入不同的洗脫溶劑分別將雜質與待測化合物分離，從而純化待測化合物。
SPE洗脫有兩種方式：
一、雜質吸附保留在柱子上，而待測化合物在柱子上不保留自然流出，或用洗脫劑先洗脫下來；
二、待測化合物吸附保留在柱子上，雜質先被洗脫下來，最后再將待測化合物洗脫下來。
是指利用化學反應將難以檢測或者不穩定的待測目標物定量轉化成類似的可被分析檢測或穩定的衍生化合物，通過測定衍生化合物含量而間接對待測目標物進行定量。對于質量數小的目標化合物，通過衍生化反應可增大目標化合物的質量數，提高分析的準確度。另外，衍生化法可提高離子化的效率，增加檢測的靈敏度。
表1 常用的生物樣本前處理方法比較
生物樣本前處理技術 | 優點 | 缺點 |
PPT | 簡單，方便，適合于大批量樣本處理。 | 1、需要有機試劑量比較大，容易稀釋目標分析物，影響樣本檢測； |
LLE | 1、可根據需要靈活選擇有機試劑萃取； | 1、對強極性化合物萃取效率低，無法去除磷脂類物質，存在磷脂的基質干擾； |
SLE | 1、無需額外的震蕩過程，不會使溶液乳化； | 1、SLE小柱增加分析成本； |
SPE | 1、萃取效率高，可實現樣本富集； | 1、使用SPE柱增加分析成本； |
衍生化法 | 提高離子化效率，檢測靈敏度高。 | 1、需要特定的衍生化試劑，操作繁瑣，耗時較長； |
除以上常用的樣本前處理方式外，近年發展起來的樣本前處理技術還有液相微萃取、在線固相萃取、免疫親和等方法，目前也有部分的廠家在研發生物樣本前處理自動化的設備。隨著技術的發展，生物樣本前處理技術正一步步往簡單化和自動化的方向發展。相信在不久的將來，臨床質譜實驗室將會實現前處理-分析-出具報告全過程自動化，從整體上提高質譜分析的效率，減少質譜分析的誤差，降低質譜分析的人力成本和時間成本，讓質譜更好地服務于臨床！
參考文獻：
[1]?張君仁，臧恒昌.體內藥物分析.北京：化學工業出版社，2002.
[2]?王思合，程雅婷等.臨床色譜質譜檢驗技術.北京：人民衛生出版社，2017年.
[3]?陳曉華，汪群杰.固相萃取技術與應用.北京：科學出版社，2009.
