DNA連接酶(DNA ligase)介紹
DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發現的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA
連接酶催化成磷酸二酯鍵。
常用的DNA連接酶有兩種：來自大腸桿菌的DNA連接酶和來自噬菌體的T4DNA連接酶。二者的作用機理類似。
T4DNA連接酶作用機制：
T4連接酶作用分三步：
(1) T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶－AMP復合物。
(2) 酶－AMP復合物結合到具有5’－磷酸基和3’－羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
(3) 產生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.
但是分子生物學試驗中主要采用T4DNA連接酶，因該酶在正常條件下，即能完成連接反應。T4 DNA
連接酶是一單鏈多肽，分子量為68,000道爾頓，它能催化雙鏈DNA上相鄰的3 羥基和5
磷酸末斷形成磷酸二脂鍵。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6個片斷均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA
連接酶作用下，可連接成原來的線狀DNA。
T4DNA連接酶連接要求和結果
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外源DNA末端性質 |
連接要求 |
連接結果 |
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不對稱粘性末端 |
兩種限制酶消化后，需純化載體以提高連接效率 |
載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留；非重組克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。 |
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對稱性粘性末端 |
線形載體DNA常需 磷酸酶脫磷處理 |
載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；外源 DNA會以兩個方向插入到載體中。 |
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平端 ? |
要求高濃度的DNA和連接酶 |
載體與外源DNA連接處的限制酶切位點消失；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；非重組克隆的背景較高。 |
1. 一般性質： 大腸桿菌的DNA連接酶是一條分子量為75KD的多肽鏈。對胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與 NAD(而不是ATP)反應形成酶-AMP中間物，但不能繼續將AMP轉移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。DNA連接酶在大腸桿菌細胞中約有300個分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子數相近，這也是比較合理的現象。因為DNA連接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙后封閉 DNA雙鏈上的缺口。這在DNA復制、修復和重組中起著重要的作用，連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA復制、修復和重組。噬菌體T4DNA連接酶分子也是一條多肽鏈，分子量為60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化過程需要ATP輔助。T4DNA連接酶可連接DNA- DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外，NH4C1可以提高在大腸桿菌DNA連接酶的的催化速率，而對T4DNA連接酶則無效。無論是T4DNA連接酶，還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連接。
