分子信標的原理、應用及其研究進展

摘要 分子信標技術是一種基于熒光共振能量轉移現象（FRET）和堿基互補配對原則建立起來的一種分析技術。分子信標作為一種熒光標記的分子探針，具有極強的特異性和較高的靈敏度，目前已經成為基礎醫學和生物學的重要研究工具。本文著重介紹了分子信標的基本原理及其應用，并對其近年來的研究進展做以簡單介紹。

1 引言

在基因時代和蛋白質時代，人們迫切需要一種具有高靈敏度和高親和力的生物分子探針，用以進行定性和定量檢測。1996年Tyagi和Kramer首先建立了分子信標技術，很快這種技術就廣泛的應用于醫學、生物學、分子生物學、臨床醫學和化學等諸多領域。

分子信標技術具有極高的特異性，而且操作簡便、靈敏度高，特別是它可以進行實時定量檢測、甚至可以用于活體分析。在臨床診斷、基因檢測等領域，分子信標也越來越顯示出它的優勢。近年來，人們對分子信標的結構作了諸多改進，發展出很多具有更多特性的新型分子信標。隨著分子信標的發展，該技術也必將在更多領域中發揮出它的優勢。

2 分子信標的原理

分子信標是一種熒光標記的寡核苷酸鏈，一般含有25～35個核苷酸。在結構上，分子信標大體上可以分為三部分：

（1）、環狀區：一般由15～30個核苷酸組成，可以與靶分子特異結合；

（2）、莖干區：一般由5～8個堿基對組成，在分子信標與靶分子結合過程中可發生可逆性解離。

（3）、熒光基團和淬滅基團：熒光基團一般連接在5ˊ端；淬滅基團一般連接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團。根據Foerster理論，中心熒光能量轉移效率與兩者距離的6次方成反比。所以只有熒光基團與淬滅基團之間達到一定的距離時才會產生熒光。

自由狀態時，分子信標呈發卡式結構，從而熒光基團和淬滅基團相距較近（約7～10nm）。此時發生熒光共振能量轉移，使熒光基團發出的熒光被淬滅基團吸收并以熱的形式散發，熒光幾乎完全被淬滅，熒光本底極低。當分子信標與靶分子結合時，熒光基團和淬滅基團之間的距離加大，從而，分子信標的熒光幾乎100%恢復。而且所檢測到的熒光強度與溶液中靶標量成正比。

3 影響分子信標的主要因素

分子信標中，熒光基團和淬滅基團之間的距離是影響分子信標的最主要因素。根據Foerster理論，熒光基團與淬滅基團之間的距離直接影響熒光的強度。

另外，溫度也是影響分子信標的一個重要因素。在較低溫度下，分子信標才可以保持發卡結構。在較高溫度下，分子信標將無法保持其發卡結構，甚至使其伸展為隨機線狀，造成熒光基團和淬滅基團分離，從而發出熒光，出現假陽性結果。有文獻表明，其熔鏈溫度取決于莖干區的長度、G-C含量和緩沖液的離子強度。

Bonnet等研究溫度對分子信標影響時發現，體系的熒光強度呈現為一個先減弱后增強的過程。就此，Bonnet等做出如下解釋：

在較低溫度下，分子信標與靶標結合呈S1狀態，發出熒光。隨著溫度升高，分子信標與靶標分離，分子信標重新恢復為發卡式結構即S2狀態，從而熒光強度減弱。溫度持續增高，將導致分子信標熔鏈即S3狀態，熒光基團與淬滅基團分離，導致熒光恢復。

環境pH值也是影響分子信標的一個因素。pH值過高，分子信標的發卡結構可能被破壞，出現假陽性結果。此外，分子信標的純度，也將對分子信標產生影響。