一、項目名稱

　　免疫固定電泳（HYDRAGEL IMMUNOFIXATION）

　　二、檢驗方法名稱

　　瓊脂糖凝膠免疫固定電泳

　　三、方法學原理

　　血清蛋白電泳中出現的異常條帶主要存在于β-球蛋白和γ-球蛋白區域，通常疑為單克隆蛋白質并且提示丙球蛋白血癥。為鑒別異常條帶，可運用免疫固定技術。免疫固定電泳是一種簡單的技術，電泳后的蛋白質與相應抗體形成復合物和被固定在相應的位置上，通過下列四個步驟：

　　1、蛋白質在瓊脂糖凝膠內進行電泳分離。

　　2、電泳后已分離的蛋白質被固定并產生免疫沉淀：應用固定劑和抗血清加于凝膠表面的泳道上，并讓固定劑和抗血清在凝膠內滲透擴散。

　　3、使用吸水紙和清洗將未沉淀的蛋白質去除，已被沉淀的蛋白質貯留在凝膠內。

　　4、將蛋白質染色，并將這些免疫沉淀區帶的位置與蛋白質經電泳后觀察到的異常蛋白區帶進行比較。

　　為了精確識別單克隆區帶，樣品同時在六條泳道上進行測試。經電泳后，ELP作為參考泳道以顯示電泳后的蛋白質。其余五條泳道用于鑒定單克隆成分。通過它（們）與抗血清，γ(IgG)、α(IgA)、μ(IgM)重鏈和κ、λ輕鏈（游離和非游離）反應與否進行鑒別。該技術簡單、快速、圖象清晰，易于解釋結果。

　　四、方法學溯源

　　自1930年由Tiselius發現了移界電泳（moving boundary eectrophoresis），而后，這種技術的各種局限性已逐漸被區帶電泳（zone elecrrophoresis）所克服，區帶電泳的條件和支持介質的選擇是電泳成敗的關鍵。通過免疫化學手段觀察其電泳特性及抗原特性是鑒定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定電泳技術是目前應用最廣泛的方法之一。

　　五、儀器

　　（一） 型號：SEBIA HYDRASYS (PN1210)

　　（二） 分析和計算參數：

　　1、處理量：約18個樣本/小時

　　2、所需樣本量：10ul

　　3、檢驗時間：約55分鐘

　　4、重復性：有良好的批內和批間重復性

　　5、電泳參數：電壓0－300V（可選至3000V）

　　電流0－500mA

　　功率0－100W

　　六、試劑及配套品

　　（一）試劑

　　1、HYDRAGEL 1 IF試劑盒

　　HYDRAGEL 2 IF試劑盒

　　HYDRAGEL 4 IF試劑盒

　　HYDRAGEL 9 IF試劑盒

　　（1） 商標：SEBIA

　　（2） 包裝規格：10測試/20測試/40測試/90測試

　　（3） 貨號：PN4301/ PN4302/ PN4304/PN4309

　　2、脫色液

　　（1） 商標：SEBIA

　　（2） 包裝規格：Pack for 10×100ml

　　（3） 貨號：PN4540

　　（4）成分：檸檬酸

　　3、洗滌液

　　（1） 商標：SEBIA

　　（2） 包裝規格：Pack for 10×80ml

　　（3） 貨號：PN4541

　　（4） 成分：疊氮鈉

　　4、稀釋劑

　　（1） 商標：SEBIA

　　（2） 包裝規格：Pack for 1×5ml

　　（3） 貨號：PN4587

　　（二） 配套品

　　IF試劑抗體

　　（1） 商標：SEBIA

　　（2）包裝規格：Pack for 5×1ml

　　（4） 貨號：PN4315

　　七、操作步驟

　　（一）開機，啟動電泳儀。

　　（二）將1只（用于1，2IF），2只（用于4IF）或3只(用于9IF)點樣梳置于整表面，有數字的一端向上，在2分鐘內完成每塊加樣梳的加樣，每孔加10ul樣品，然后齒梳向上把加樣梳放于濕盒內5分鐘。

　　電泳/免疫固定泳道

　　孔號 ELP GAM K L Kf Lf

　　Hydrasys 1 IF 1 2 3 4 5 6

　　Hydrasys 2/4 IF

　　1或3號樣本 2 3 4 5 6 7

　　2或4號樣本 9 10 11 12 13 14

　　Hydrasys 9 IF

　　1,4或7號樣本 1 2 3 4 5 6

　　2,5或8號樣本 7 8 9 10 11 12

　　3,6或9號樣本 13 14 15 16 17 18

　　（三）選擇相應的“IF”電泳程序

　　（四）從包裝袋內取出緩沖條，將其固定在電極支架背側的釘上，再取出凝膠，用薄濾紙快速輕輕地吸去凝膠表面多余的液體，在溫控板表面下1/3處加200ul蒸餾水或去離子水，將凝膠片底邊緊靠框架底邊，邊緣對齊邊線，略彎曲凝膠片慢慢放平，注意凝膠片下面勿出現氣泡。

　　（五）自然放下支架，從濕盒中取出加樣梳并去除齒梳下的保護支架，1、2IF的點樣梳置于支架6號位，4IF的2只點樣梳則分別置于3號和9號，9IF的3只點樣梳則分別置于2，6號和10號，注意點樣梳上的數字必須面對操作者，關上電泳艙蓋，按下鍵盤左側的綠色箭頭“START”鍵，電泳開始，確保儀器右側的空氣通道不被堵塞。

　　（六）電泳儀自動發出蜂鳴聲，提示電泳結束，進行免疫固定操作。打開電泳蓋，將加樣梳和緩沖條丟棄，移走兩支架，用濕紙巾擦拭電極絲，將抗體加樣條裝入抗體加樣架上，按如下要求將動物血清抗體加入抗體加樣條：

　　1、Hydrasys 1 IF用6孔抗體加樣條：每孔加8μl抗體

　　2、Hydrasys 2/4IF用15孔抗體加樣條：2人份每孔加8μl抗體，4人份每孔加12μl抗體

　　3、Hydrasys 9 IF用18孔抗體加樣條：每孔加8μl抗體

　　4、固定好抗體加樣架，將抗體加到凝膠片上。然后關上電泳艙蓋，按“Start”鍵開始免疫固定。

　　（七）10分鐘后，電泳儀自動發出蜂鳴聲，提示“PAPER BLOTTING” ，移走抗體加樣架，棄去抗體加樣條，放一厚濾紙光面向下蓋于于凝膠表面， 左手固定好濾紙，右手手指用力的摩擦濾紙表面，注意勿將濾紙移動，關閉電泳艙蓋，按“Start”鍵開始凝膠表面多余抗體的吸收。

　　（八）3分鐘后，電泳儀自動發出蜂鳴聲，打開電泳艙蓋，移去濾紙，關閉艙蓋，按“Start”鍵開始凝膠片的干燥。

　　（九）6分鐘后，電泳儀自動發出蜂鳴聲，打開電泳艙蓋，取出凝膠片，用濕紙巾擦拭溫控板，將膠片固定于凝膠支架上放入染色空間中，在檢查洗液瓶中是否有400ml洗液，染色液瓶內是否有300ml染色液，脫色液瓶內是否有1000ml脫色液以及是否排空了廢液瓶后，菜單上選擇染色指令，按“Start”鍵開始染色。

　　（十）在染色、脫色以及干燥步驟完成后，電泳儀自動發出蜂鳴聲，取出凝膠支架，將烘干的膠片取下。

　　八、臨床意義

　　對多發性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥、分泌型骨髓瘤、輕鏈病、重鏈病等研究有重大意義。

　　九、標本要求

　　（一）取新鮮血清進行分析，根據臨床實驗室對各種試驗所使用的操作程序進行血清樣本的采集，樣本置于冰箱內（2～8℃）可保存一周，若冰凍可延長保存時間至少一個月。冰凍的血清樣本加入0.02g/dl的疊氮鈉可以增加其存放穩定性。

　　（二）為避免抗原過剩引起的帶現象，血清于加樣前應先作如下稀釋，并混勻。

　　泳道 血清(ul) 稀釋劑(ul)

　　蛋白電泳 (ELP)和其他免疫球蛋白固定泳道 30 60

　　IgG免疫固定泳道 20 100

　　（三）特殊情況

　　1、當總免疫球蛋白的水平＞20g/L，稀釋劑量加倍（除了ELP泳道）

　　2、當總免疫球蛋白水平＜5g/L，稀釋劑量減半（除了ELP泳道）

　　3、冷藏或冰凍后，某些樣本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝膠）可能變得粘稠或混濁。這種樣本可能由于擴散障礙而存在點樣問題。在這樣情況下，加25ul液化劑于75ml血清中，混勻15秒。然后按規定程序繼續進行。

　　4、某些單克隆蛋白質可能因多聚體而導致所有的免疫固定泳道上均出現單克隆片段。在這樣情況下（i）準備1％β－巰基乙醇（這種還原劑可在室溫于未封閉微管內保存1周）（ii）加25ul還原劑于75ul血清中（iii）混勻并令其反應至少15分鐘（至多3小時）后按規定程序繼續進行。

　　（四）避免使用血漿標本。

　　十一、操作注意事項

　　（一）為達到最佳檢測效果，同一試劑盒內的所有組分必須一并使用。

　　（二）用薄濾紙吸去凝膠表面多余液體時，接觸時間不能太長，應快速移去，以免凝膠脫水。