試驗目的 血清分型

　　標本 出血熱恢復期病人血清

　　材料

　　1、 毒株 漢灘病毒標準株 76－118，漢城病毒標準株 Seoul；

　　2、標準血清 兔抗漢灘病毒、漢城病毒血清；

　　3、空斑減少中和試驗常用試劑。

　　步驟

　　1、將待檢血清用牛血清Hanks 氏液稀釋成1：10，56℃滅活30分鐘；

　　2、進一步2倍稀釋血清成1：20、1：40、1：80……，對照血清1：10稀釋；

　　3、稀釋兩種病毒（在冰浴中進行）至含200pfu/ml；

　　4、各連續稀釋度血清分別與200pfu/ml的兩種病毒液等量混合（各0.3ml），置37℃中作用1小時（每15分鐘振蕩一次）；

　　5、吸出各細胞培養孔中維持液；

　　6、接種長滿單層的Vero-E6細胞（24孔板），每孔接種血清病毒混合液、標準血清對照及兩種病毒對照 ，每稀釋度兩孔，100ul/孔。37℃吸附1小時，每隔15分鐘搖動一次；

　　7、加第一層瓊脂糖覆蓋液（需冷置42℃左右），每孔1ml，室溫下待凝固，細胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培養7-9天；

　　8、加第二層含中性紅瓊脂糖覆蓋液，1ml/孔，室溫下待凝固，細胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培養2-5天，從第二天開始觀察空斑數；

　　9、抗體滴度的判定，以比病毒對照的空斑數中和或減少50%的血清最高稀釋度倒數判為待檢血清中和抗體滴度；

　　10、型別判定：根據同一份血清與兩種病毒的反應滴度不同來區分，如果一份血清與漢灘病毒 （或漢城病毒）反應的抗體滴度高于與漢城病毒（漢灘病毒）的抗體滴度4倍或以上，即判為漢灘病毒型，反之則為漢城病毒型。兩者滴度相差無幾時，則不好分型。不足4倍時亦不能定型。

　　配方

　　1、第一層瓊脂糖覆蓋液

　　2、第二層瓊脂糖覆蓋液 基本上同第一層瓊脂糖覆蓋液，僅將滅活胎牛血清改為5ml，另加中性紅溶液1ml（333.0ug/L中性紅鈉鹽Gibco）。