聚乙二醇(PEG)沉淀實驗檢測CIC
PEG使IC沉淀的機理可能在于使其自液相中空間排斥而析出,此外,PEG還可抑制CIC解離,促進CIC進一步聚合成更大的凝聚物而被沉淀。在被檢血清中加入低濃度PEG,可將血清中的IC沉淀下來,利用透光率比濁或散射比濁法可測出CIC的存在與含量。本法簡便易行,國內已廣泛應用。
1、試劑
(1)0.1mol/L pH8.4硼酸鹽緩沖液(borate buffer solution,BBS) 硼酸(H3B03)3.40g,硼砂(Na2B407·10H20)4.29g,蒸餾水溶解后,加至1 000mL。用G3或G4玻璃濾器過濾。
(2)PEG-NaF稀釋液 PEG6000 40.9g,NaF 10.0g,用BBS溶解后加至1000mL,用G3或G4玻璃濾器過濾。
(3)熱聚合人IgG 將人IgC(10mg/mL)置63℃水浴加熱15rain,立即置冰浴內,冷卻后過Sepharose4B柱或SephacrylS-300柱,收集第一蛋白峰。所獲熱聚合人IgG可用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。也可取人IgG(10mg/ml)10ml,攪拌下滴加1.8%戊二醛100uL,24h后加入0.4mol/LpH5.4,Tris-HCl緩沖液100uL終止反應,過Sepharose 4B或Sephacryl S-300柱,用0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液洗脫,收集第一蛋白峰。加入牛血清白蛋白至0.5%,分裝后-40℃保存。試驗中可用作陽性對照和制備標準曲線。
2、操作步驟
(1)取待測血清0.15ml,加BBS0.3ml(1:3稀釋);
(2)按表10-1加入各液(待測血清最終稀釋倍數為1:33,PEG最終濃度為3.64%);
(3)將測試管及對照管置37℃水浴60rrfin;
(4)分光光度計在波長495nm測吸光度,用對照管調零。
3、結果判斷
待測血清濁度值:(測定管吸光度—對照管吸光度)×100。以大于正常人濁度值的均值加2個標準差為CIC陽性。
參考值:4.3±2.0,以大于或等于8.3為CIC陽性。或以不同濃度熱聚合人IgG按以上方法操作制備標準曲線,根據待測血清吸光度值查標準曲線,即可得IC含量(相當于熱聚合人IgG的ug/mL)。
4、注意事項
(1)低密度脂蛋白可引起濁度增加,故應空腹采血;
(2)高丙球血癥或血脂含量過高及標本反復凍融,均可導致IC檢測出現假陽性;
(3)此法快速、簡便,但特異性較差,較適用于血清標本的篩查。