膠體金在快速檢測中應用及未來發展趨勢
在過去的5年中,應用金顆粒及層析的檢測法日益確立了其在床旁檢測中的地位。針對不同分析物的簡易層析檢測法的出現簡化并加速了檢測體系,也對諸多企業產生重大影響。例如,可以在臨床問診過程中利用病人的一滴血液、尿液或者唾液做出精確的診斷結果,這樣當病人仍在場時就可以立即開始治療了。同樣地,食品生產公司可以在食品加工的不同階段運用質控檢測而無需專門的實驗室人員也無需中斷生產加工過程。另外,層析檢測還可應用于獸醫行醫、食品貯藏和環境監測等領域,而無需專門德操作設備和培訓以及結果的闡釋。再加上反應的快速,使得層析成為一種理想的自我檢測手段。
用于制作膠體金的溶液成分
用于制造層析檢測的材質在不斷改進,也伴隨著試驗設計的不斷改善,這些進步使得更多可產生定量結果的層析檢測使用量的需求有所增加。隨著數十億元全球性的體外診斷檢驗市場的不斷增加,這些促進因素同樣可以導致快速檢測手段的多樣化和實驗室分析的便利。這篇文章討論了這種多樣化的起因,并概括了一些膠體金可適用于各種診斷應用的特性。
膠體金在層析檢測中的使用
層析檢測常采用兩種顆粒:染色乳膠和膠體金。許多最近開發的層析檢測,包括Phadia AB公司(瑞典,Uppsala)的Immunocap Rapid 快速試驗和Merck KgGA公司(德國,Darmstadt)為檢測食源性病原體開發的Singlepath和Duopath試驗,都選用納米金作為標記物。
顆粒大小 用于層析檢測中納米金顆粒要比膠乳顆粒小,用于檢測中硝酸纖維素膜的孔徑為8-10微米,可一次容納大量納米顆粒。這種檢測形式的敏感性取決于顆粒和被分析物在沿著膜向吸附線移動時的混合程度(見圖1)。而另一個重要的因素就是小顆粒在吸附線上緊密堆集從而更易識辨。
圖1層析快速檢測示意圖
IDV制造商必須從聲譽良好的供應商處購買膠體金以確保滿足嚴格的質控標準使得顆粒的大小和尺寸均一,這些也是保持診斷產品能自由凝集及穩定儲存的主要因素。膠體金是一種均質的顆粒溶液,顆粒具有均一的表面積和電荷,滿足了蛋白附著的兩個主要標準。
顆粒大小范圍 用于層析檢測的膠體金顆粒的大小范圍為5-200nm.顆粒尺寸的范圍使得其可應用于不同領域。較小的顆粒可應用于生命科學領域。
為了利用層析檢測應用中大顆粒的強可識辨特征,顆粒的均一性是關鍵的。優質的膠體金顆粒必須是單分散性的、球形的,而且形狀不均一的粒子數應少于5%。其他規格的膠體金會使得實驗結果不佳,并造成時間和資源的浪費。而優質的膠體金每升可以產生更多的實驗結果。
可辨識性 范圍在20-120nm的膠體金可散發綠光因而可出現鮮紅色。即使顆粒小于透射光波長由于表面等離子共振作用它仍可以發光。被散發出的可視光波長因顆粒尺寸的大小而異。
蛋白結 不同于用于膠乳中的共價結合,蛋白質如抗體是被動結合于膠體金上的。這種結合是一種相對簡單的過程無需使用其他試劑。有三種常用的金顆粒結合模式存在。
標準的膠體金顆粒被一層負電離子包被著,在離子結合過程中,所有蛋白質上的正離子可以牢牢結合在顆粒的表面。當使用檸檬酸制作金顆粒時,顆粒會與氨基酸如賴氨酸結合。
具有高度疏水性的氨基酸(如酪氨酸和色氨酸)通過疏水作用結合到金等顆粒的表面。對于疏水性氨基酸含量很高的蛋白質(如免疫球蛋白)來說,疏水結合起著重要的作用,這也是結合顆粒長時間接觸含有洗滌劑的緩沖液后反應性降低的原因。
金硫鍵是由金和硫共用一個電子對而形成的牢固連接。金微粒與蛋白內的半胱氨酸殘基的連接可能是吸附于顆粒上抗體或抗原的最重要部分。因此,應避免使用硫柳汞等含硫緩沖液或防腐劑。
可調控性 經過嚴格的質控程序可持續生產出尺寸符合要求的均一圓形膠體金顆粒。多年的發展經驗已經消除了批量生產中的變異因素及大批量供應的難題(如圖2)。膠體金的連接方式簡單,僅僅涉及到蛋白、稀釋液及微粒而無需反應劑。根據規定的原材料,IDV生產者可以計算出每粒膠體金所需要的能做出最佳檢測結果的精確的抗體數量,從而節約成本減少原材料的浪費。
圖2 優質的圓形納米金變異系數低、形態一致、具有最佳的抗體吸附力和靈敏度。 層析檢測中原材料的改進 用于層析檢測的原材料質量的改進已經提高了檢測的性能。
顆粒 工藝上的改進可以不斷生產出大量大尺寸(250nm)圓形膠體金顆粒,可作為市場上多種標記物。40nm大小的顆粒被認為是最適于層析檢測的。這種大小的尺寸既足夠大到易于識辨又足夠小到不會對蛋白結合到膠體金表面產生空間位阻從而優化標記原材料的性能。隨著顆粒尺寸的增加,其辨識性也有所增加。最初的研究表明,應用60nm的膠體金可以增加某些檢測中末端信號的辨識性,從而有可能提高測試的敏感性。
圖3 尺寸分布對比數據表明標記40 nm的膠體金平均直徑達143nm
硝酸纖維素膜 這種硝酸纖維素膜的一個重要特征就是其孔徑的大小可以控制蛋白結合的有效表面積及樣品通過測試條帶的毛細管流速。劣質膠體金易于聚集,不能自由通過纖維素膜,因而膠體金顆粒的大小必須均一。IDV制造商還必須保證膠體金尺寸的規格。
尺寸分布比較顯示,生產粗劣的膠體金標記為40nm,可能包含不同尺寸的顆粒,其平均直徑可以達到143nm,而導致錯誤的結果(如圖3)。新型硝酸纖維素膜被制成可濕水的,不影響蛋白質吸收和測試功能。利用表面活性劑和某些阻滯劑進行產品的后期處理可提高顆粒的流動性,消除測試組份間的非特異性相互作用。