免疫測定（immunoassay，IA）是利用抗原抗體反應檢測標本中微量物質的方法。基于抗原抗體反應的特異性和敏感性，免疫測定的應用范圍遍及醫學檢驗的各個領域。任何物質只要能獲得相應的特異性抗體，即可用免疫測定進行檢測。

可測定的對象包括：具有免疫活性的免疫球蛋白、補體、細胞因子等；微生物的抗原和相應的抗體；血液凝固因子；以及臨床化學測定中微量而難于分離的物質，如蛋白質、同工酶、激素、藥物、毒品等。

由于免疫測定在醫學檢驗中的地位日益重要，近年來新方法、新技術不斷出現。從總體上說，其進展主要在自動化和簡便化兩個方面。

一、 免疫測定自動化[1，2，3]

隨著檢驗醫學的發展，檢測項目和標本量急劇增加，在大型實驗室中自動化系統取代手工操作是必然的趨勢。20世紀50年代生化自動分析儀即取得實際應用。免疫測定在技術上有其特殊性，自動化發展較遲，20世紀80年代后才有自動化分析系統問世。目前除放射免疫測定外，幾乎所有的免疫測定方法均可進行全自動分析。

按分析過程的不同，免疫測定可分為均相（homogenous）和異相（heterogenous）兩大類。標本中的抗原與試劑抗體反應后，形成結合的抗原抗體復合物和剩余的游離抗體；測定兩者之一即可計算出標本中抗原的含量。在一般情況下需將結合的（B）和游離的（F）分離后再進行測定，此為異相。在特殊情況下，B和F具有不同的特性，不必分離即可進行測定，此為均相。均相和異相兩種免疫測定在自動化系統的設計中具有各自的特點。

1、均相免疫測定

（1） 免疫濁度測定

這是最簡單的免疫測定方法。標本中待測抗原與試劑抗體（一般為特異性抗血清，也可用抗體包被的微粒以提高敏感度）混合，反應后形成顆粒性的抗原抗體復合物而導致反應液混濁，而剩余的游離抗體不產生濁度。因此不必進行B和F的分離即可通過濁度測定而計算出標本中抗原的含量。

免疫濁度可以采用臨床化學中的透射濁度法（turbidimetry），通過測量透射光的減弱而進行測定。因此只要有合適的試劑，可以在生化分析儀中作全自動分析。另一種方法為散射濁度法（nephelometry），通過測量顆粒的散射光以反映濁度的強弱。

散射濁度儀一般與試劑配套供應。全自動分析系統有Beckman-Coulter公司的Array和Immage，以及Dade-Behring公司的Nephelometer 100和BN ProSpec等。Array和Nephelometer 100已被廣泛應用。新型的Immage 和BN ProSpec將于2002年在我國推出。免疫濁度測定的敏感度約為50ng/ml，最適用于測定血漿蛋白的含量。

（2） 均相標記免疫測定

用于小分子物質特別是藥物濃度的測定。模式為競爭法，即標記的抗原與標本中的抗原競爭結合特異性抗體，然后進行標記物的測定。在特定的情況下，與抗體結合的標記物失去其特性，因此不需將B與F分離即可直接測定F中標記物的量。

a、 均相酶免疫測定

1972年Syva公司開發的酶擴大免疫測定技術（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）和1992年Microgenics公司開發的克隆酶供體免疫測定（clone enzyme donor immunoassay，CEDIA）均屬均相酶免疫測定，酶標記的抗原與抗體結合后，其中的酶就失去其活性。酶活力的測定方法與臨床化學法相同，因此應用這兩種方法的試劑在生化自動分析儀即可進行標本的檢測。也有專用于EMIT和CEDIA的全自動分析儀。

b、 熒光偏振免疫測定

在熒光偏振免疫測定（fluorescence polarisation immunoassay，FPIA）中，熒光素標記的抗原與標本中的抗原競爭結合特異性抗體，反應后用單一平面偏振的光源照射，熒光素被激發產生偏振熒光。偏振熒光的強度與分子轉動的速度成反比。標記抗原與抗體的復合物分子量大，旋轉慢，偏振熒光強；游離標記抗原的分子量小，偏振熒光弱。因此不需進行B和F的分離即可進行測量。這一技術在20世紀80年代即被Abbott公司用于藥物濃度的測定，其開發的自動分析系統名為TDx。

2、異相免疫測定

大部分標記免疫測定均屬異相。最常用的B和F的分離手段為固相載體的洗滌，但在臨床化學測定中無此步驟。因此異相免疫測定的自動化不能借助于生化自動分析儀，各種方法均有其特殊的自動分析系統。

（1） 固相酶免疫測定

通用的名稱為ELISA，即酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay）。在ELISA中通常用聚苯乙烯為固相載體，有微孔板、小管、小珠、微粒、磁性微粒等類型。不同形式的固相載體要求不同的洗滌裝置。

a、微孔板式自動分析儀

不同廠家生產的板式ELISA試劑種類繁多，但均采用規格統一的8×12的96孔微板。因此儀器廠生產的板式ELISA自動分析儀均為"開放式"的，即適用于各家的試劑產品。微孔板每一孔的徹底清洗是ELISA的關鍵，亦是自動分析的難點。因此直至近年才有全自動的板式分析儀問世。Bio-Rad公司的CODA自動酶免疫分析儀和Dynex公司的DIAS型微孔板自動處理系統均可同時進行多塊微板的全自動測定。

b、其他形式固相載體的自動分析儀

微孔板以外的固相載體形式，其自動分析系統均為試劑與儀器配套型的。

管式載體的特點是小管可同時作反應和比色的容器。Boehringer Mannheim公司開發的ES300型分析儀是管式的配有專用試劑的全自動分析系統，在國內曾被不少單位采用。但自該公司并入Roche公司以后，各型ES儀器已停止生產。

Abbott公司最早采用0.6cm直徑的小珠作為載體，小珠放在相應大小的塑料孔盤中滾動沖洗，屬半自動類型。Roche公司的COBAS COREⅡ自動分析儀則采用粒徑較小的小珠，為全自動的分析系統。

Abbott公司應用膠乳微粒作為載體的MEIA（微粒子酶免疫測定）自動分析系統較小珠型更為先進，膠乳微粒可吸附在玻璃纖維膜上進行洗滌。這種自動分析系統稱為IMx，現在與TDx合并組成全能型的Axsym系統。

磁性微粒表面積大，可用磁鐵吸引進行分離，是較為理想的載體。瑞士Serono公司的酶免疫分析儀屬此類型。這種載體已被其他標記免疫測定所采用。

（2） 時間分辨熒光免疫測定

早在1941年熒光抗體已應用于免疫組化技術。但熒光免疫測定則發展較遲，作為定量分析必須克服熒光本底高和熒光猝滅的難點。1983年Soini和Kojola用新型的熒光物質作為標記物，建立了時間分辨熒光免疫測定（time resolved fluorescence immunoassay）。

其基本原理是鑭系元素銪螯合物被激發后產生的熒光壽命比一般的熒光長，因此可待短壽命的本底熒光衰退后再進行測量。以此原理開發的自動分析儀稱為DELFIA（dissociation-enhanced lanthanide fluorescence immunoassay），現在由芬蘭Wallac公司生產。固相載體亦為微孔板。與板式ELISA分析儀的主要不同點為采用特殊的時間分辨熒光計進行測量。

（3） 化學發光免疫測定

化學發光免疫測定（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是近年來發展的標記免疫測定。化學發光底物在化學反應后發出的光子可通過發光光度計（luminometer）進行測量。化學發光免疫測定分三種類型，均有自動分析儀器供應。

a、化學發光酶免疫測定

這是采用化學發光劑作為酶反應底物的酶標記免疫測定。經過酶和發光兩級放大，具有很高的靈敏度。

Amersham公司早期開發了以過氧化物酶為標記酶、以魯米諾為發光底物、并加入發光增強劑以提高敏感度和發光穩定性的化學發光酶免疫測定系統AMERLITE，經Johnson & Johnson 公司改良后商品名為VITROS Eci。Beckman Coulter公司生產的ACCESS應用的標記酶為堿性磷酸酶，發光底物為dioxetane磷酸酯，固相載體為磁性微粒。特殊的試劑組合保證了測試的穩定性和重復性。類似的分析系統有Diagnostic Production Corporation 公司的IMMULITE。

b、化學發光免疫測定

這是以化學發光底物直接標記抗原或抗體的免疫測定方法。吖啶酯是較為理想的發光底物，在堿性環境中即可被過氧化氫氧化而發光。Chiron公司生產的ACS180是以吖啶酯為標記物、以磁性微粒為載體的自動分析系統，可作為這一類型的代表。該儀器現由Bayer公司生產，新的型號ADVIA CENTAUR將于2002年在我國推出。應用一種性能優良的吖啶酯衍生物，Abbott公司開發了新型化學發光免疫測定系統ARCHITECT，亦將于2002年在我國上市。

c、電化學發光免疫測定[4]

電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）的原理為：發光底物二價的三聯吡啶釕及反應參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個H+而成為強還原劑，將氧化型的三價釕還原為激發態的二價釕，隨即釋放光子而恢復為基態的發光底物。這一過程在電極表面周而復始地進行，不斷地發出光子而常保持底物濃度的恒定。

Boehringer Mannheim 公司利用電化學發光原理開發的免疫測定系統稱為ELECSYS，1997年投入大量生產。在該系統中并采用鏈霉親和素包被的磁性微粒，配以生物素結合的抗原或抗體，使反應幾乎在液相中進行，具有敏感、快速和穩定的特點，在固相標記免疫測定中技術上居領先地位。ELECSYS有1010和2010兩種型號，現由Roche公司生產。新產品為模塊式的E170儀器，將于2002年在我國推出。

二、免疫測定簡便化

免疫測定另一方面的進展為簡便化。簡便化的特點是：檢測方法簡單而快速，數分鐘即可得出結果；不需儀器設備，操作人員不需特殊訓練；試劑穩定，適用于單份測定。近幾年發展的固相膜免疫測定[5]完全符合以上要求，成為目前“病人身邊檢驗”（point-of-care testing，POCT）[6]中廣為應用的方法。

固相膜免疫測定的特點是以硝酸纖維素膜為載體和有色微粒作為標記物。最常用的標記物為紅色的膠體金，因此一般稱為金免疫測定。在這種測定中，B和F的分離有滲濾和層析兩種形式。

1、金免疫滲濾試驗

免疫滲濾試驗（immunofiltration assay，IFA）始創于1985年，最初以酶作為標記物。1989年Du Pont公司推出了用于檢測抗HIV抗體的金免疫滲濾試驗（GIFA），確立了GIFA的基本技術。

GIFA是只需試劑，不需儀器的檢測方法。試劑盒有兩個主要組份：一個為金標記的抗體，另一為滲濾裝置。該裝置為一充滿吸水墊料的塑料小盒，盒蓋中央小孔下放置硝酸纖維素膜一片，膜上包被抗體或抗原。試驗時將標本滴加膜上，通過滲濾抗原抗體在膜上反應；然后滴加金標抗體，滲濾反應如上。陽性結果在膜上出現紅色斑點。全過程在數分鐘內完成。

90年代初期GIFA展開了多方面的研究和開發，用于檢測各種傳染病的抗體和腫瘤標志物等。國內1991年即有GIFA試劑生產，用于檢測尿液HCG的“金標”早孕診斷試劑取得了廣泛應用。

2、金免疫層析試驗[6]

1990年Oskiowicz等建立了免疫層析試驗（immunochromatography assay,ICA），其原理與IFA相同；不同點在于液體的移動不是通過直向的穿流（flow through），而是基于層析作用的橫流（lateral flow）。Oskiowicz應用的標記物為膠體硒，其后一般均采用簡便的膠體金，稱為金免疫層析試驗（GICA）。

GICA試劑為試紙條形式。在一塑料片條上依次粘貼如下組份：（1）吸水紙；（2）玻璃纖維膜，膜上固定著干燥的金標抗體；（3）硝酸纖維素膜，膜上包被著線條狀的抗體；（4）吸水紙。以上各組份首尾互相銜接，因此在（1）處滴加液體標本，液流即向（4）處移動。當液體到達（2）處時，金標抗體被溶解，同時與標本中的抗原反應而形成復合物。液流繼續前移至（3），金標記的復合物再與膜上的抗體結合而呈現紅色的線條，多余的金標抗體繼續前移至（4）處。

GICA的特點是單一試劑，一步操作。干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上。

GICA試劑結構簡單，小型實驗室即有條件開發生產。近年來發展生產GICA試劑的單位如雨后春筍，目前試劑的品種已多達數十種，測定項目包括HCG、LH等激素，腫瘤標志物，傳染病的抗原和抗體，心血管病標志物等，并有繼續發展的趨勢。

金免疫測定中應用的是單份試劑，難于進行質量控制[7]。即使是同一批生產的試劑，也很難保證每個試劑的同一性。因此金免疫測定一般只能用于定性試驗。最近由于原料的精選和制作工藝的改進，已能制備出可用于定量測定的GICA試劑。Roche公司生產的用于急性心肌梗死診斷的肌鈣蛋白和肌紅蛋白的GICA試劑和匹配的簡便測讀器Cardiac Reader，其精密度和準確性均符合定量測定要求[7]。另一種類似的定量測定心肌標志的免疫層析測定系統，應用熒光物質作為標記物，由美國Biosite公司生產，商品名TRIAGE Cardiac Panel[6]。

三、結束語

隨著免疫學技術和自動化技術的發展，免疫學測定取得了突飛猛進的發展。值得注意的是，不論自動化還是簡便化，直接的研究和開發幾乎全部由生產單位所推動。回顧國內，國產自動分析儀尚屬空白；國內免疫測定試劑的生產正在向高質量和穩定性方面努力，創新產品鳳毛麟角。

可喜的是進入新世紀以來，在簡便化的領域中國內已研發出與國際同步的檢測系統，如AFP和HCG的金標定量測定系統和測定腫瘤標志的蛋白芯片系統均即將問世。相信在不久的將來在免疫測定的領域中我們一定能躋身于國際先進行列。

參考文獻

1、陶義訓主編.免疫學和免疫學檢驗.第2版.北京:人民衛生出版社,1997,140-180 2、Gorman EG,Arentzen R,Bedzyk W,et al.An overview of immunoassay automation.In:Price CP,Newman DJ,eds.Principles and practice of immunoassay.2nd ed.U.K.:Macmillan Reference Ltd,1997,300-3233、Chan DW.Automation of immunoassays.In:Diamandis EP,Christopoulos TK,eds.Immunoassay.San Diego:Academic Press,1996,483-5044、鄭佐婭,陶義訓.電化學發光免疫測定.臨床檢驗信息,1998,5:10-125、陶義訓.固相膜免疫測定.上海醫學檢驗雜志,2000,15:258-2606、Price CP,Hicks JM,(eds).Point-of-Care Testing.Washington:AACC Press,1999 7、Muller-Bardorff M,Rauscher T,Kampmann M,et al.Quantitative bedside assay for cardiac troponin T:A complementary method to centralized laboratory testing.Clin Chem,1999,45:1002-1008