原位PCR的反轉錄

原位PCR的反轉錄不同于原位PCR的過程包括兩個：即蛋白酶消化后用無RNA酶的DNA酶消化過夜和原位PCR的反轉錄過程。此處主要介紹這兩個過程，其余方法同原位PCR。

1．DNA酶消化

【試劑與配制】

無RNA酶的DNA酶

10×緩沖液：35μl 3mol/L NaAc，5μl 1mol/L MgSO4，60μl DEPC水

【操作方法】

① 在蛋白酶處理過的玻片上加入1μl 10×緩沖液，1μl無RNA酶的DNA酶（10U/μl），8μl DEPC水；

② 用一個滅菌的聚丙烯塑料封條蓋住溶液以防蒸發，將載玻片置于37℃的濕盒內；

③ 消化過夜，除去封條，用DEPC水洗1min，再用無水乙醇洗，空氣干燥。

2．反轉錄

【操作方法】

① 在DNA酶消化的切片上，加入下列溶液：2μl 25mmol/L MgCl2，1μl RT緩沖液，1μl 10mmol/L dNTP，1.5μl DEPC水，0.5μl 20μmol/L 3’端引物，0.5μlRNA酶抑制劑，0.5μl反轉錄酶；

② 用一滴指甲油固定封條以防蒸發，將載玻片放入PCR儀的加熱板上，蓋上礦物油，42℃反應30min；

③ 出掉封條，二甲苯洗5min除油，用無水乙醇洗5min，空氣干燥；即可進行PCR擴增，方法同上。