定位克隆的核心是連鎖分析技術

定位克隆的核心是連鎖分析技術 ? ??? 連鎖是一種遺傳 現象，是指當同一條染色體上的某些位點由于相距很近，在減數分裂過程中這些位點發生交換的概率較小，所以就有較多的機會連鎖在一起，從親代傳遞到子代。位點間的距離越近，在減數分裂過程中發生交換的可能性越小，位點間重組的概率就越小；相反，兩位點越遠，則越容易產生重組體。這是利用連鎖分析將致病相關基因從染色體中搜尋出來的定位克隆基礎，為疾病基因定位提供了有力的手段。鑒于致病相關基因及其鄰近的遺傳標記在世代傳承過程中存在共分離或共遺傳的現象，因此，通過對覆蓋密度適當的遺傳標記在家系中進行分型，以此找到與致病相關基因緊密連鎖的某一遺傳標記，從而確定該基因在染色體上的大體位置。在此基礎上，在該染色體區域再使用覆蓋密度更高的遺傳標記作深入的連鎖分析、單倍型分析或連鎖不平衡分析，就可將致病相關基因確定在較小的區域。這樣，就能對該區域內有限數目的基因進行篩選，確定致病相關基因。這種方法最適用于有多個患者的大家系研究，當前一些致病相關基因的發現主要也是通過家系連鎖分析發現的。 ??? 由于人類基因組序列已知，一旦發現了與致病相關基因連鎖的兩側遺傳標記，根據遺傳標記的具體位置，我們就可以知道定位區域內所有的基因。隨后在該區域內選擇候選基因直接進行測序，對所發現的SNP在患者和對照組進行分型并分析，搜尋致病相關基因。另一個方法是直接從公共數據庫挑選候選基因編碼區、調控區(包括內含子)中的SNP，進行連鎖不平衡分析，確定致病相關基因。連鎖分析其實就是一種計算的手段，通過數學模型，推斷出那些具有統計學意義的與疾病共分離的基因組區段，而這些區段內很有可能含有易感位點。圖1―2簡明扼要地概述了通過家系尋找致病相關基因的基本過程。 定位克隆疾病相關基因的常規流程 ??? 定位克隆的核心是連鎖分析技術，最為經典的一個例子是在1989年僅僅利用限制性片段長度多態性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)進行連鎖基因定位(1inkagemapping)，克隆了囊性纖維化的致病基因。要想取得連鎖基因定位的成功。先決條件是所收集的家系成員疾病表型分型必須正確，需將表型評定的不確定性降至最低。連鎖的推斷過程基本上是一個統計過程，一旦混淆了研究群體中的患者．將會造成研究的偏差。因此，在諸如Huntington舞蹈病和囊性纖維化等診斷很明確、疾病與表型非常一致的孟德爾遺傳病中，連鎖基因定位取得了巨大的成功，并且通常能在接近理論人數最小值的情況下獲得成功。而在那些存在診斷錯誤、遺傳異質性、復雜性狀或擬表型等情況下，特別是那些將不同疾病的患者或健康人員歸人患病組，即使是大樣本．其連鎖分析也會失敗。 ??? 有時也可利用一些相對簡單的統計學糾正措施，或能從一些噪聲中鑒定出連鎖信號，成功的例子有乳腺癌的易感基因BRCAl。現已清楚，只有15％一20％有乳腺癌家族史的乳腺癌患者是因BRCAl或BRCA2引起。研究者結合此前的流行病學調查結果，發現在早發性乳腺癌患者中連鎖信號大為提高。正由于研究者一開始并未注意到上述現象以及考慮到遺傳異質性的問題，未能為BRCAl定位在17號染色體上的結果提供有力的統計學證據。隨后正是因為注意到這些問題，成功地定位克隆了BRCAl。然而，采取一些糾正措施雖然能提高成功率，但有些致病相關基因的鑒定分離過程卻頗費周折。遺傳異質性、誤診和復雜性狀等因素的存在必然增大研究難度，并通常可引起連鎖分析的假陽性結果。倘若分析結果一開始就不明確，這時可應用其他合適的連鎖分析方法，對這些結果重新進行分析，檢測是否因一些不同表型(如發病年齡、臨床癥狀)等因素所致。同時根據初次分析的結果，在另一批樣本中驗證是否系表型不同等因素所致。重復性是孟德爾遺傳病以及多基因疾病的致病相關基因研究結果準確性的驗證方法。 ??? 至今所找到的疾病相關基因，大多數是在單一簡單的顯性、共顯性、隱性或X―連鎖等孟德爾遺傳病家系中所定位克隆的。如果有足夠的家系材料，理論上連鎖分析可以將致病相關基因定位至1―10cM的區域內，但這樣的家系往往很難獲得。通常的標準程序是連鎖分析定位至5～locM后，再在該區域內選擇分布密度更高的一套遺傳標記，對原樣本進行精細定位。但有時即使有足夠多的微衛星或SNP等遺傳標記可供利用，也很難進行精細定位，因為分辨率仍取決于發生交換的減數分裂的數量。在理想情況下(如囊性纖維化)，研究對象中含疾病相關基因區域中的交換程度使得最終定位區域只含少數幾個基因。而較為不利的情況是，最終定位的區域含有幾百個基因，這樣對疾病相關基因的鑒定造成很大的困難。 ??? 盡管理論上定位克隆不需知道疾病的生物學或基因功能方面的知識，但實際上定位區域內候選基因生物學功能的評價卻是該策略很重要的一個環節。精細定位后，收集定位區域內各個基因的信息，倘若某個基因與疾病的病理過程相關，則這個基因就可列為候選基因。典型的例子是“功能明確候選基因策略”(well―informedcandidate gene)成功地定位克隆那些含有引起嚴重高血壓或低血壓的突變基因。但往往是定位克隆了疾病相關基因后，該基因與疾病之間的關系才被人所知，這也是定位克隆的目的所在。