一、雜交瘤技術的誕生

淋巴細胞雜交瘤技術的誕生是幾十年來免疫學在理論和技術兩方面發展的必然結果，抗體生成的克隆選擇學說、抗體基因的研究、抗體結構與生物合成以及其多樣性產生機制的揭示等，為雜交瘤技術提供了必要理論基礎，同時，骨髓瘤細胞的體外培養、細胞融合與雜交細胞的篩選等提供了技術貯備。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英國《自然》雜志上發表了題為“分泌具有預定特異性抗體的融合細胞的持續培養”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤細胞與經綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合。

融合由仙臺病毒介導，雜交細胞通過在含有次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培養基（HAT）中生長進行選擇。在融合后的細胞群體里，盡管未融合的正常脾細胞和相互融合的脾細胞是HGPRT+，但不能連續培養，只能在培養基中存活幾天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤細胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤細胞不能在HAT培養基中存活，只有骨髓瘤細胞與脾細胞形成的雜交瘤細胞因得到分別來自親本脾細胞的HGPRT和親本骨髓瘤細胞的連續繼代特性，而在HAT培養基中存活下來。實驗的結果完全像起始設計的那樣，最終得到了很多分泌抗綿羊紅細胞抗體的克隆化雜交瘤細胞系。用這些細胞系注射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同質的抗體，即單克隆抗體。

這一技術建立后不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細胞系等方面即得到改進。最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發現聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問題，從而得到廣泛的應用。隨后建立的骨髓瘤細胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，所以由它們產生的雜交瘤細胞系，只分泌一種針對預定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細胞MOPC-21等的不足。再后來又建立了大鼠、人和雞等用于細胞融合的骨髓瘤細胞系，但其基本原理和方法是一樣的。

二、基本程序和方法

雜交瘤技術在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節中介紹的方法是作者所在實驗室采用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內大多數實驗室。

在開展雜交瘤技術制備單抗之前，培養骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設備：超凈工作臺、CO2恒溫培養箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細胞培養瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細胞培養板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細胞計數板，可調微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細胞的篩選與檢測的儀器設備，依據檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節有關部分。

淋巴細胞雜交瘤技術的主要步驟包括：動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細胞雜交瘤技術研制單抗的主要過程。

1、動物免疫

（1）抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。

（2）免疫動物的選擇根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。

（3）免疫程序的確定免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細胞融合形成雜交細胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。

免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最后一次加強免疫后第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞，這在最后一次加強免疫后第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道采用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天后即可融合。

2、細胞融合

（1）主要試劑的配制

①細胞培養基雜交瘤技術中使用的細胞培養基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎培養基，具體配制方法按廠家規定的程序，配好后過濾除菌（0.22um），分裝，4℃保存。

?不完全RPMI-1640培養基：RPMI-1640培養基原液96ml

100×L.G.溶液1ml

雙抗溶液1ml

7.5% NaHCO3溶液1-2ml

HEPES溶液1ml

?不完全DMEM培養基：DMEM 13.37g

超純水或四蒸水980ml

NaHCO3 3.7g

雙抗溶液10ml

100×L.G.溶液10ml

用1N HCl調試PH至7.2-7.4，過濾除菌，分裝4℃保存。

?完全RPMI-1640或DMEM培養基：不完全RPMI-1640或DMEM培養基80ml

小牛血清15-20ml

用于骨髓瘤細胞SP2/0和建株后的雜交瘤細胞培養。

?HT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基99ml

HT貯存液1ml

?HAT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基98ml

HT貯存液1ml

A貯存液1ml

②氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L）

稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

③次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液（100×，H：10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L）

稱取136.1mg次黃嘌呤（Hypoxanthine，MW 136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，MW 242.2），加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。

④L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）

稱取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。

⑤青、鏈霉素（雙抗）溶液（100×）

取青霉素G（鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g，溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。

⑥7.5% NaHCO3溶液

稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。

⑦HEPES溶液（1mol/L）

稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。

⑧8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）

稱取200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養液中（即終濃度為20ug/ml）。

⑨50% PEG

稱取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6ml分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養基，用少許7.5% NaHCO3調PH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現成產品。

（2）髓瘤細胞的準備

融合前骨髓瘤細胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標是使細胞處于對數生長的時間盡可能長，融合前肯定不能少于1周。凍存的細胞在復蘇后要2周時間才能處于適合于融合的狀態，長過了的骨髓瘤細胞至少幾天才可能恢復。在實驗室中處于對數生長的骨髓瘤細胞維持在含10%小牛血清的培養基中，方法是用6個裝5ml培養基的培養瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細胞。1周后到細胞相當密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。

骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下

①于融合前48-36小時，將骨髓細胞擴大培養（一般按一塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100ml培養瓶培養的細胞進行準備）。

②融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集于50ml離心管或融合管內。

③1000r/min離心5-10分鐘，棄去上清。

④加入30ml不完全培養基，同法離心洗滌一次。然后將細胞重懸浮于10ml不完全培養基，混勻。

⑤取骨髓瘤細胞懸液，加0.4%臺盼藍染液作活細胞計數后備用。細胞計數時，取細胞懸液0.1ml加入0.9ml臺盼藍染液中，混勻，用血球計數板計數。計算細胞數目的公式為：每毫升細胞數=4個大方格細胞數×105/4；或每毫升細胞數=5個中方格細胞數×106/2

（3）脾淋巴細胞的準備

取已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，于解剖臺板上固定后掀開左側腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml不完全培養基的平皿中，輕輕洗滌，并細心剝去周圍結締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內芯擠壓脾臟），使脾細胞進入平皿中的不完全培養基。用吸管吹打數次，制成單細胞懸液。為了除去脾細胞懸液中的大團塊，可用200目銅網過濾。收獲脾細胞懸液，1000r/min離心5-10分鐘，用不完全培養基離心洗滌1-2次，然后將細胞重懸于10ml不完全培養基混勻，取上述懸液，加臺酚藍染液作活細胞計數后備用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108個脾細胞，每只大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細胞。

（4）飼養細胞（Feeder cells）的制備

在細胞融合后選擇性培養過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。

常用的飼養細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：

按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml HAT培養基將沉淀細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加HAT培養基，使細胞濃度為2×105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，96孔培養板每孔需2×104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每只小鼠可得3-5×106個細胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板的飼養細胞。也可在細胞融合前1-2天制備并培養飼養細胞，這樣使培養板孔底先鋪上一層飼養細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當于2滴），然后置37℃ 6% CO2的培養箱中培養。

（5）細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養

細胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實驗室常用的一種。

①將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。

②1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。

③在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細胞松散均勻；置40℃水浴中預熱。

④用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時間為45秒）加預熱至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。

⑤用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37℃的不完全培養基；20-37℃靜置10分鐘。

⑥1000r/min 5分鐘；棄去上清。

⑦加入5ml HAT培養基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。

⑧分裝96孔細胞培養板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后將培養板置37℃，6% CO2培養箱內培養。

⑨5天后用HAT培養基換出1/2培養基。

⑩7-10天后用HT培養基換出HAT培養基；（第14天后可用普通完全培養基）。經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。