火箭免疫電泳實驗原理及操作步驟
一、實驗原理
火箭免疫電泳(rocket immunoelectrophoresis,RIEP)是將單向免疫擴散和電泳相結合的一種定量檢測技術。電泳時,含于瓊脂凝膠中的抗體不發生移動,而在電場的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動。
當抗原與抗體分子達到適當比例時,形成一個形狀如火箭的不溶性免疫復合物沉淀峰,峰的高度與撿樣中的抗原濃度呈正相關。因此,當瓊脂中抗體濃度固定時,以不同稀釋度標準抗原泳動后形成的沉淀峰為縱坐標,抗原濃度為橫坐標,繪制標準曲線。根據樣品的沉淀峰長度即可計算出待測抗原的含量;反之,當瓊脂中抗原濃度固定時,便可測定待測抗體的含量(即反向火箭免疫電泳)。
二、實驗材料
(一)材料和試劑
1、PH8.6,0.1M巴比妥--巴比妥鈉緩沖液
巴比妥鈉 10.3 g
巴比妥 1.84 g
硫柳汞 100 mg(防腐劑)
蒸餾水加熱溶解并定容至500ml
2、1%預復瓊脂(或瓊脂糖)
1g瓊脂(或瓊脂糖)加蒸餾水100ml溶化即可。
3、1.5%瓊脂糖凝膠
1.5g瓊脂糖加50ml蒸餾水置水溶中煮沸溶解或用與波爐加熱溶解(注意不要溢出且注意加入蒸發的水),然后再加入50ml上述巴比妥緩沖液混勻,置4℃保存備用。
4、抗原及相應免疫血清。
(二)設備和器材
玻璃板、模具,打孔器和挑針、滴管、有蓋搪瓷盒(內鋪有濕潤的濾紙)、溫箱(25℃)、三角燒杯、玻璃攪拌、微量加樣器、其他常用器材。
三、操作步驟
1、抗原、抗體濃度的選擇
以分別固定抗原含量與抗體濃度的方法,選取最小抗原量與最低抗體濃度,在免疫電泳后能出現最清晰項端狹窄且尖的錐形沉淀峰,長達2~5cm者為標準。一般抗原用量為0.5~5微克,抗血清用量為5~10微升,稀釋度于1:10~1:200之間進行選擇。
2、預復瓊脂玻板的制備
將溶化的1%預復瓊脂用滴管加玻板上,使之能將表面覆蓋即可,放于溫箱內干燥(或自然干燥),即可用以制備凝膠板。
3、抗血清瓊脂板制備
根據上述選擇結果,取一定量抗血清與一定量融化并冷卻至56℃的1.5%巴比妥緩沖瓊脂混合,使抗血清的濃度為以上述方法選擇出的最適濃度,澆制抗血清瓊脂板。瓊脂厚度為1~2mm,玻板大小可根據實驗所需而確定。如用5×7.5cm大小玻板時,約需抗血清瓊脂6ml.
4、打孔、加樣
待瓊脂凝固后,于距玻板一長邊10mm處,以3mm孔徑打孔器打孔一排,孔距5mm.于各孔中加入抗原液,每孔10微升。每次實驗中應加入幾個不同濃度的標準抗原以作對照。稀釋范圍包括標本含量的最高與最低水平。
5、電泳
將瓊脂板置于電泳槽橫梁上,加樣端位于負極,以雙層濾紙聯接瓊脂板與電泳槽內緩沖液(槽內緩沖液為0.06M pH8.6巴比妥緩沖液)。接通電源,板端電壓3v/cm,電流強度3mA/cm,電泳5小時。
6、結果判定(電泳結果示意圖點擊展開)
電泳畢,取出瓊脂板,依次用生理鹽水、蒸餾水浸泡后,加1%鞣酸沖洗瓊脂板,晾干,即可觀察與測定結果。也可以常規蛋白質染色法染色后觀測結果。測定結果的方法有兩種:一是測量沉淀峰的高度(自孔中央至峰尖),以mm計;另一是以求積儀測量沉淀峰的面積,以mm2計。前者較簡便,后者較準確。根據測定的結果,從標準曲線中計算出待檢標本中的抗原含量。
7、標準曲線制定
用上述選擇好的最適濃度抗血清制備瓊脂板。打孔,加入合適比例的5~10個標準抗原濃度,反復試驗10次,取每次電泳后所測定的沉淀峰高度(或面積)的平均值,繪出標準曲線。