C3裂解產物C3d的定量檢測

C3d的定量檢測采用ELISA雙抗體夾心法，其原理為抗C3d血清能與C3、C3b、C3bi發生交叉反應，根據C3SP與C3在不同濃度PEG中溶解度的不同，用11%PEG溶解待測樣本中C3d，然后加至包被抗C3d反應板中，再依次加入HRP標記的抗C3d抗體和底物OPD/H202，用4mol/L H2S04終止反應，于492nm讀取吸光度，C3d含量與其吸光度呈正相關。

1、10mmol/LEDTA抗凝正常人或病人全血，2500rpm離心10min,取血漿置-70℃保存。

2、C3d標準品的制備 將菊糖按3mg/mL與正常人血清混合，37℃孵育1h，2000r/min離心30min，取上清作為C3d標準品。100ulC3d標準品加等體積22%（W/V）PEG60004℃孵育1h，混合物于4℃2000r/min離心30min，取上清用含0.01%BSA的PBS 1：1000稀釋，然后對倍稀釋到1：2000。

3、用1.0ug/mL、5.0ug/mL、10.0ug/mL三個濃度的兔抗人C3d抗體（Dakpatt產品）分別包被三個酶標板，每孔100t，4℃24h，次日取出，每孔加含1%BSA的PBS 100/uL，37℃21h，然后加上述稀釋的上清100uL混勻，37℃反應1h，用0.5%酪蛋白緩沖液洗滌3次，加100uL1：1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗人C3d抗體，37℃ 45min，用0.5%酪蛋白緩沖液洗滌2次，最后用PBS洗1次，每孔加l00uL0.4mg/mL OPD底物溶液，然后加4mol/L H2S04終止反應，于酶標儀上492nm讀取OD值。

4、樣本中C3d的檢測 選擇上述反應性好，結果清楚的酶標板的抗體濃度作為工作濃度，包被酶標板，4℃24h。取待檢樣本（血漿、尿液或腦脊液）100/uL加l00g/L 22%（W/V）PEG6000，4℃反應1h，然后4℃2000r/min離心30min，取上清。正常人血漿上清1：250稀釋、尿液1：8稀釋釋、腦脊液1：32稀釋，病人血漿上清1；1000稀釋、尿液、腦脊液同正常人，稀釋液為PBS。用含0.01%BSA的PBS從1：400-1：600對倍稀釋C3d標準品，然后將各稀釋度的C3d標準品和稀釋的樣本各100t分別加入包被有兔抗人C3d抗體的酶標板中，隨后操作同步驟3。

5、結果計算 樣本C3d的定量測定用AU/L（設想單位）表示，C3d標準品1：250稀釋度被指定為1600AU/L，依次類推。標準曲線濃度范圍為100-6.25AU/L，以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線圖，根據標準曲線計算待測樣本中C3d含量。

正常值：血漿為8.48±1.91AU/L（X±1SD），尿液為0.87±0.61mAU/L。