補體C4高壓電泳及免疫固定技術

1、原理 用神經氨酸酶和羧肽酶B處理EDTA抗凝血漿，神經氨酸酶的作用主要是去涎，羧肽酶B能切除分子p鏈C端的堿性氨基酸，去除副帶，將經過兩酶處理后的EIJE4抗凝血漿進行高壓電泳，然后與抗C4血清作用形成沉淀帶，將其漂洗后用考馬斯亮藍染色，參照第六屆國際補體定型會議C4定型標準或C4標準血清，判斷以的同種異型。

2、所需試劑

（1）羧肽酶B（carboxypeptidasetype I，Sigma）10mg/ml（170U/mg） 將羧肽酶B分裝于若干支EP管中，每管15uL，-20℃保存，用時取出一管加lOOmmol/LNaCl至80g/L(可供17份樣本用)；

（2）神經氨酸酶（neuraminidasetypeⅥ）IOU 將250rtl 0.2mol/L EDTA加入盛有神經氨酸酶的瓶中，-20℃保存。7.5ul EDTA抗凝血漿加2ul神經氨酸酶；

（3）抗C4血清 用時1:4或1:2稀釋；

（4）透析緩沖液（pH6.8） NaH2P04 84.80g，Na2HP04 66.20g，Na4-EDTA 25.00g，加蒸餾水至2L，透析時用蒸餾水1:5稀釋；

（5）EDTA緩沖液（pH7.2） Na2-EDTA（MW 336.20） 33.62g,Na4-EDTA（MW 380.20） 38.20g，加蒸餾水至1L；

（6）電極緩沖液（pH8.8） 三羥甲基氨基甲烷（Tris）90.40g、甘氨酸 112.40g、巴比妥 27.40g、NaOH 2.92g加蒸餾水至4L；

（7）脫色液 甲醇900ml、冰醋酸200ml、蒸餾水900ml；

（8）染色液 考馬斯亮藍3.02，加脫色液至1L；

（9）0.75％瓊脂糖 稱取0.75g瓊脂糖（1CN或SEAKEM.M.E），加3mL0.2mol/L EDTA，38mL電極緩沖液，加蒸餾水至100ml，加熱熔化。

3、操作步驟

（1）將透析液約幾倒人一有蓋方盤內，方盤上放一玻璃板，玻璃板上鋪4層紗布，將透析膜貼在紗布上，不應有氣泡。取7.5ul EDTA抗凝血漿與2ul神經氨酸酶、3ul羧肽酶B在透析膜上混合，然后利用虹吸法4℃透析過夜。

（2）將0.75%瓊脂糖隔水煮沸或在微波爐中加熱至瓊脂糖溶液完全透明為止，立即傾注于125×260× 3mm玻璃板上，待其冷卻。

（3）在凝膠板離陰極0.5cm處鋪上2cm寬的4層濾紙，待濾紙完全浸濕后，輕輕揭掉；貼上塑料加樣板，每孔加透析完畢的樣本IOuL，留二孔分別加血紅蛋白和C4分型標準品，靜置30min，待樣本完全浸入瓊脂糖凝膠中，揭掉加樣板。將加樣完畢的凝膠板放在冷卻循環電泳槽上，樣本放在陰極，打開冷卻循環泵（10℃），接通電源控制電流在65～80mA，電泳45rain或待血紅蛋白遷移到離加樣孔6～7cm處，停止電泳。

（4）將抗C4血清1:2或1:4稀釋，均勻鋪在電泳完畢的瓊脂糖凝膠上，37℃30～45min，然后放人生理鹽水中漂洗過夜，次日換一次生理鹽水。漂洗后，用一層濾紙鋪在凝膠板上，上面放2打皺紋紙用重物壓住，待凝膠中水分吸干后放37℃烘干，然后放人0.3%考馬斯亮藍染色液中染色15rain，再放人脫色液中脫色，直至背景清晰為上。

（5）依照第六屆國際補體定型會議分型標準或將待測樣本與C4分型標準血清比較，判斷待測樣本的同種異型。

（6）C4缺乏（幟Q0）的判斷：染色完畢的凝膠板，在激光掃描儀上進行條帶密度掃描，以C4A及C4B條帶密度掃描結果求取A/B比值，比值等于1g寸表示C4A、C4B可能不存在零基因，比值大于1時表示C4B可能存在一個零基因，比值小于1B寸表示C4A可能存在一個零基因。