噬菌體多肽展示文庫及其新藥研究中的應用

一、概況

噬菌體展示技術（Phage Display Technology）在80年代中期產生， Smith G第一次描述了在絲狀噬菌體表面展示外源多肽片段的原理。

該辦法主要是用DNA重組技術將大量的多肽編碼順序導人噬菌體的衣殼蛋白基因中，從而使表達出的各種多防以與PIII或PVIII蛋白融合的形式出現在噬菌體的表面，即首先構建噬菌體多肽展示文庫。10多年來在構建噬菌體展示多肽文庫方面以及用生物學方法－biopanning從該文庫中篩選出與已知靶物質相結合的多防編碼順序方面取得了巨大的進展。

近年來，在識別蛋白或受體的小肽順序的鑒定上、在結構和功能上模擬已知蛋白的多肽模擬物的研究上、在篩選鑒定能與人類病毒、細胞、組織及腫瘤等生物靶系統結合的多肽研究日益增加。

噬菌體多肽展示庫提供了這樣的可能勝：可從多肽展示庫中分離出一個能與重要蛋白如與炎癥有關的抗體、與介導細胞粘著的整合蛋白等特異性結合已具有相應生物活性的多肽。

特別是有可能發現一些多助配基而導致多肽模擬藥物（peptidomimetic drugs）的產生。噬菌體及庫有廣泛的應用，它不僅可以展示小肽，而且可以展示較大的蛋白，如單鏈抗體。

絲狀噬菌體是在菌毛陽性的細菌中繁殖的，它不造成細菌的裂解，而可使細菌分泌出多拷貝的，在其表面展示出插入順序的噬菌體。結合到一個靶分子上的噬菌體可以被洗脫下來，然后又在細菌中生長擴增。這就是所謂生物鍋（biopanning），重復多次就可以富集結合到靶分子上的有關噬菌體。

有關結合性多肽順序可以通過編碼該多肽的噬菌體基因組部分的核苷酸順序的測定完成。最后插入的多肽順序可以用重組技術或人工合成的方法再造，通過這種方法可以發現目標受體的特異的和選擇性的配基。

在展示文庫中，多防順序被融合在最小的衣殼蛋白III的氨基端內或其附近。另一個較小程度被應用的融合對象是大的衣殼蛋白VIII。應用pIII的好處是相當大的多肽或蛋白的插入并不導致噬菌體感染力的丟失。

在每一個噬菌體顆粒上只有大約5個拷貝的pIII被錨定在噬菌體的頂端。如應用FUSE 5載體時每個pIII上都有一個插入順序，因此是一個多肽的多價顯示。過去數年來的報道表明，在體內和體外應用這個載體發現的不同靶分子的多肽配基時，多價顯示并不是一個必要的條件。

噬菌體顆粒令人驚異地能耐受苛刻的環境條件，如在pH 2.2和4-6M。

尿素的條件下而不喪失感染細菌的能力，這種特點被用來解聚靶分子和噬菌體的結合。需要注意的是結合在靶上的噬菌體并不必非從64孔板或組織上洗脫下來，通常可直接將細菌加入到64孔板或勻漿的組織中，鋪極后即可獲得有關噬菌體。

如果受體、配基作用的生物化學的細節已知的話，更特殊的一些方法也可用于洗脫。如含精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）的多肽和陽離子螫合劑如 EDTA則以使結合到 α5β1上的噬菌體解離。

二、識別短肽順序的蛋白和受體

一旦某個蛋白可以獲得純化或者轉染后在細胞表面表達該蛋白，那么多肽文庫就提供出一種可能性，去定性特異性結合到那個蛋白上的配基。在活細胞中蛋白一蛋白間的反應常常由相當大的表面積外導，但也有的只與一小段肽的結合有關。

噬菌體展示多肽文庫特別適宜研究隊指導下的分子間反應。噬菌體多肽展示文庫最重要的應用就是確定抗體的抗原決定簇。抗體能識別小肽通常僅基于3－4個保守的氨基酸。噬菌體展示揭示出的多肽，描繪出被抗體識別的蛋白區是可能的。牽涉到自動免疫失常的抗體的決定簇的確定可能對疾病的免疫機制給予重要的信息。

噬菌體展示的一個多肽也可以反向應用去產生一個抗展示的多肽的抗體。絲狀噬菌體是一個非常強的免疫原，由它可以分離出一個特殊的噬菌體展示的多肽的抗體。

在免疫系統中存在著一些可以識別小肽的分子。主要的組織相容性分子（MHC）的功能就是識別在宿主的細胞表面上的來源于內源和外源的蛋白。當一個細胞變得不正常，或者被有害的微生物侵入宿主時，基于結會到MHC分子的多肽順序，免疫系統可以識別。噬菌體展示文庫一直被用來描述每一種MHC分子所識別的多肽結構。

細胞表面整合蛋白家族可以識別三防RGD。這些整臺蛋白介導細胞粘附多種含有RGD的細胞外的基質蛋白，例如纖維粘連蛋白，vitronectin和fibyiflogen。篩選噬菌體展示庫已經證明整合蛋白α5β1、αLib、β3、αvβ3、αvβ5當中每一種都有略微不同的肽段的特異結合性，而且樂于結合獨特的環狀二硫鍵順序中的RGD的多肽。

這反映出每一種整合蛋白對不同胞外蛋白的不同的嗜好性。已發現篩選出的結合。α5β1的多肽含CRGDGWC順序，而對αvβ5的結合多肽有更為復雜的結構CDCRGDCFC（又稱RGD－4C），這個整合蛋白結合多肽含有4個半脫氨酸，這些半眈氨酸的配對可形成不同二硫鍵的混合物。由半胱氨酸隨機氧化而合成制備的雙環多肽的活性足以導致細胞的粘連，后來的實驗又證明另一種二流鍵的排列能給出更具活性的多肽。

用噬菌體展示多肽常常揭示出新的不曾料到的多肽配基。用α5β1整合蛋白可篩選出一個環形的多肽CRRETAWAC，它反過來又是這種整合蛋白特異的配基，而不與整合蛋白家族的其他成員結合。這個多肽能防止α5β1介導的細胞對纖維粘連蛋白的粘連。

另外一種整合蛋白結合的是NGR，幾乎是RGD的反向順序。NGR順序出現在許多蛋白的順序中，如纖維粘連蛋白，但它對整合蛋白只有相當低的親和力。NGR在墓質蛋白和整合蛋白反應中的作用還不清楚。

噬菌體展示文庫也常用來選擇并不識別RGD或NGR，但能識別其它基質蛋白的整合蛋白的配基，如α6β1，（一種膜層蛋白）和αMβ2（一種免疫球蛋白樣的粘和蛋白的白細胞受體）。

能以兩種假性對稱方式I和II之一種結合Src同源區III（SH3）的配基也用噬菌體展示研究過。SH3存在于許多蛋白激酶中，并結合信號分子的脯氨酸富集區。

I型的保守順序是RPLLPPLP，而II型是反方向肋APPLPPR。蛋白中出現的脯氨酸富集區與激酶反應，卷入了信號傳導。多肽文庫也用來發現另一個蛋白激酶和信號傳導蛋白的共同區SHZ的配基。SHZ區識別一個含有磷酸化的酪氨酸的多肽。