牛狂犬病毒抗體 酶聯免疫分析（ELISA ）

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用 ? ????? 目的：本試劑盒用于測定牛血清，血漿及相關液體樣本中 狂犬病毒抗體 的表達。

實驗原理：

? 本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯免疫法（ ELISA ）測定標本中牛 狂犬病毒抗體 。用純化的牛 狂犬病毒 抗原 包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中 狂犬病毒抗體 相結合 ，經洗滌除去未結合的抗原和其他成分后 再與 HRP 標記的 狂犬病毒 抗原 結合，形成抗原 - 抗體 - 酶標抗原復合物，經過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（ OD 值），與 CUTOFF 值相比較，從而判定標本中牛 狂犬病毒抗體 的存在與否。

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試劑盒組成 ：

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樣本處理及要求 ：

1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100 萬 /ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持 2-8℃ 的溫度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可 將標本放于 -20 ℃ 保存，但 應避免反復凍融 .

7. 不能檢測含NaN3的樣品 ，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（ HRP ）活性。

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操作步驟：

1.???????? 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照 2 孔、 陽性對照 2 孔、空白對照 1 孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）

2.???????? 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照 50μl 。然后在 待測樣品孔先加樣品稀釋液 40 μl ，然后再加待測樣品 10 μl 。 加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，

3.???????? 溫育：用封板膜封板后置 37 ℃ 溫育3 0 分鐘。 ??

4.???????? 配液：將 30 （ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至 600ml 后備用

5.???????? 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。

6.???????? 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl ，空白孔除外。

7.???????? 溫育：操作同 3 。

8.???????? 洗滌：操作同 5 。

9.???????? 顯色：每孔先加入顯色劑 A 50μl ，再加入顯色劑 B