噬菌體展示抗體庫構建的載體
噬菌體展示抗體庫構建的載體
抗體庫技術是將某種動物的所有抗體可變區基因克隆在質粒或噬菌體中表達,利用不同的抗原篩選出攜帶特異抗體基因的克隆,從而獲得相應的特異性抗體
單鏈抗體(ScFv)是一種基因工程抗體,能夠在原核宿主中表達,不論是在性能方面,還是在制備方面,均具有獨特的優越性。關于基因工程抗體的特點與制備過程,見本書第一章的有關內容。這里僅介紹噬菌體展示技術在制備單鏈抗體中的應用,說明該技術的操作過程。
pFUW80是一個多拷貝的噬菌粒載體,用于表達單鏈抗體基因。它同時具有colEl的復制起始位點和絲狀噬菌體f1的復制起始位點。但是,pFUW80缺少編碼噬菌體復制和包裝所需蛋白的基因,這些基因均由輔助噬菌體提供。這樣,pFUW80既可以進行一般質粒的雙鏈復制;在輔助噬菌體存在下,又能像絲狀噬菌體那樣滾環復制。常用的輔助噬菌體有VCM13和M13KO7,它們帶有一個編碼卡那霉素抗性基因,可以作為篩選的標志。
pFUW80表達抗體基因使用的是lacZ啟動子,載體本身并不帶有lacIq基因,要求使用染色體上帶有一個lacIq基因的宿主菌株。由于pFUW80是多拷貝載體,所以宿主菌的lacIq基因產物不足以抑制多拷貝lacZ啟動子轉錄,導致P3-抗體融合蛋白的表達存在著較強的滲漏。因此,即使不用IPTG誘導也能表達相當數量的融合蛋白,IPTG誘導僅能使表達產量提高3~6倍。
為了使融合蛋白定位在周質腔,需要將融合蛋白基因與編碼信號肽的一段DNA融合,用信號肽將融合蛋白引導到細菌細胞膜上,再與噬菌體的其他組分組裝成病毒顆粒。常用的信號有3種,pFUW80使用的是Erwinia carotovora的pelB信號肽。
pelB基因編碼E.carotovora的果膠酶,其信號肽包括21(或22)個疏水氨基酸殘基,其序列如下:-MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAM(A)-,其相對應的密碼子經過修改以利于E.coli翻譯系統的識別,序列為:ATG-AAA-TAC-CTA-TTG-CCT-ACG-GCA-GCC-GCT-GGA-TTG-TTA-TTA-CTC-GCT-GCC-CAA-CCA-GCG-ATG-(GCC)-。 當信號肽牽引著抗體-P3融合蛋白定位于周質腔后,信號肽酶作用于其第21位的Met或第22位的Ala C-側,切下抗體-P3融合蛋白分子。
在pelB與基因Ⅲ之間引入一段人工合成的寡核苷酸序列。這段序列中包含了抗體VH和VL基因的克隆位點,在重鏈和輕鏈之間還有一段連接肽序列,pFUW80的連接肽序列為(GGGGS)3,這個序列具有較大的柔性,不影響抗體分子的空間構象及抗體分子與抗原的特異性結合。在輕鏈EcoRI位點之后,有一段5個His的串聯序列,便于用二價金屬離子進行金屬螯合層析,純化抗體蛋白。
在抗體基因與基因Ⅲ之間設計了一個UAG終止密碼子,當在琥珀突變型菌株(supE)表達時,UAG被通讀為Gln,表達產物為ScFv-P3融合蛋白,附著在噬菌體表面。當在非抑制型菌株中表達時,就會在UAG處翻譯終止,產生分泌型的ScFv分子。所以pFUW80稱為附著型-外分泌雙功能表達載體。在基因Ⅲ的3端有兩個連續的終止密碼子,這種終止信號保證融合基因的翻譯在這里結束。
pFUW80上的β-lactamase基因提供了氨芐或羧芐青霉素抗性,作為篩選標志。pFUW80與輔助噬菌體提供不同的抗性標志,以保證超感染的成功。
pFUW80載體上設計的VH基因插入位點XhoI-SpeI,VL基因插入位點XbaI-EcoRI,必需與PCR引物上設計的酶切位點一致。在載體的其他位置不能再有這些位點,如果有的話,要利用定點突變技術去掉。pFUW80的上述特點使得它不僅用作表達載體,也適用于定點突變和單鏈測序。
- WESTERN BLOTTING心得
- 候選基因關聯研究與定位候選克隆
- 黏附分子表達數量改變對黏附作用的調節
- 以細胞為靶目標的噬菌體肽篩選結果鑒定
- 細胞因子在抗體產生中的作用
- 整合素家族白細胞黏附受體組(β2組)
- 組織芯片
- Visualisation of Lymphoid Organ Development
- Measurement of Matrix Metalloproteinase Activities in the Medium of Cultured Synoviocytes Using Zymography
- Fluorescence Labeling of Surface Antigens of Attached or Suspended Tissue-Culture Cells