抗原與抗體-微珠基質的結合

抗原與抗體-微珠基質的結合 ? ??? 雖然使抗原有效地結合到免疫親和柱上的方法很多，因為抗體是通過共價鍵交聯在微珠上，而不是游離于溶液中，所以交聯在微珠上的抗體與抗原結合所需的時間比抗體和抗原二者以游離狀態在溶液中所需的時間要長得多，因此，選用的方法應使抗原與交聯的抗體達到最大程度的結合。推薦使用兩種結合方法：將抗原溶液加入呈糊狀的抗體-微珠內，不斷混和均勻；或將抗原溶液流經抗體-微珠層析柱，保持抗原與抗體盡可能長時間的接觸。一般情況下，應首先選擇在抗體-微珠層析柱內結合。若是結果不夠理想，可以試用在溶液中結合。先用幾支小型層析柱測試最佳結合和收集抗原的條件。 ? ??? 將抗原結合到抗體-微珠基質上之前，應注意抗體的親和力與抗體-微珠基質結合抗原的容量或能力。 ? （1）親和力 ??? 雖然抗體對抗原的精確親和力可以計算，但對一般說來，實用的標準是抗體是否可以將抗原從溶液中分離出來。最簡單的方法是建立一個小規模的預實驗，測試待純化的溶液液中抗原的含量。如果抗體-微珠基質在l~2h內不能分離出大部分抗原，可以在實驗設計時作一些變動。例如使微珠上交聯更多的抗體、或增加微珠的用量、或延長結合時間，均有可能增加結合抗原的量。但這些條件變化也可能增加非特異性結合，所以一般應綜合考慮獲得最高的結合抗原量和最低的非特異性結合。另一方面，使用高親和力的抗體可以解決有效收集抗原量少的問題。其次使用稀釋的溶液，相對較低的濃度和較短的結合時間，這些條件都可降低非特異性結合。 ? （2）測定層析柱基質結合抗原的能力 ??? 首先要確定層析柱基質體積與結合抗原量的比值。可以采用免疫沉淀法。將等體積的抗體-微珠基質加到含不同濃度抗原的樣本中，在4℃中混合1h，以后的過程同標準免疫沉淀試驗。如果能夠在上述反應上清中測得抗原的量，也可以計算出被結合的抗原量。這樣就可以得出結合所需量抗原必需的層析柱基質體積。