膠體金免疫層析診斷試紙(lateral-flow)試驗結果分析方法

近日有許多朋友詢問膠體金試紙如何記錄和分析試驗結果，每次試驗面對的都是使用肉眼判斷條帶顏色深淺，不同的人對結果的判斷都不相同，容易出現誤判，平行試驗結果無法對比。且試驗結果無法直接記錄，不能留下有說服力的試驗結果證明，就這個問題，我將談我的一些看法。以下討論僅針對普通膠體金試紙，熒光，化學發光，磁粒子等特殊標記物必然需要讀條儀器。

一、現狀

很多學術論文中對膠體金試驗的結果記錄通常是羅列簡單的陰性(-)陽性(+)來表示。對于實驗結果，很少有人提供T線吸收色度值，甚至圖片來說明。嚴格的說，這些論文的真實性，可信性都很難讓人信服。 同時，在做產品的時候，QC檢測中如何去判斷產品是否合格，簡單的-，+也不能很好的說明產品質量。 有一些廠家也推出了商品化的膠體金結果讀條儀，包括BIODOT的TSR3000讀條儀，國產讀條儀和其他自制的讀條系統。 然而這些儀器又有多大作用，是否能真正快速的解決我們所遇到的問題呢?

二、原理

要分析試紙實驗結果，首先需要了解試驗結果的獲取過程。

在試紙條的T線位置，通常是由于免疫反應出現膠體金標記物的滯留，出現深紅色條帶。 我們所觀察到的是可視信號。 同一個條帶的顏色在不同的位置可能有深有淺，還會有中空，泛白，鬼線等干擾現象。 同時由于NC膜，標記物釋放，點樣過程等等問題。 在NC膜表面殘留了或多或少的金溶液殘留信號，對我們需要的信號產生干擾。

測試不同濃度的樣本，T線的顏色深淺度可能不同。且需要在做實驗過程中進行比較。

不同的處理樣品墊配方，處理T線溶液配方，膠體金溶液配方可能有不同的顏色深度。 且需要在做實驗時候進行比較。

在做老化存放實驗時，不同時間做的測試可能有不同的顏色深度，且需要在實驗過程中進行比較。

判讀結果的時間一般是滴加樣品后3分鐘或者5分鐘。(以下用3分鐘情況為舉例說明。)

那么從以上分析可知我們的需求。 在滴加樣品后，3分鐘，需要讀取可見信號，并要對付一定的干擾。 同時要將這個信號轉化為可比較的數字信號。

三、實踐

1、色卡法

如何實現用肉眼快速判別，又有一定標準，那么色卡法將是一個很好的選擇。 該方法投入資金量非常小，且能夠建立一個簡易的判別標準。實際操作情況如下。

所需資源， 標準顏色比較卡一本(印刷行業使用，廉價，僅用于顏色選定可以考慮借用)，彩色打印機(為保證色彩還原性好，可以考慮到附近的照片打印店制作)，相片打印紙若干。已經反應過的膠體金試紙條，需要強陽性，弱陽性和陰性。

制作步驟：

(1)選色，將膠體金試紙反應顯色的T線條帶顏色與標準色卡比較，選出合適的顏色，注意不同的反應濃度顏色梯度使用的標準色不同，梯度越多則做出來的色卡越準確， 一般是設置出0-9檔， 0為全陰性，9為強陽性，中間梯度遞增。

(2)將選出的顏色打印到選好的相片紙上，相片紙的背景色最好和膜的顏色保持一致，不要過白。打印的圖形應該和膠體金試紙的點樣線條一致。即從左到右，上C下T,4mm/每段線條，線條間隔>4mm,共10組(0-9檔)。 打印后一定要做覆膜否則顏色非常容易掉。

(3)在每檔的上方都標明檔次，方便比對讀數。

(4)如果要求比較高，可以以該打印色卡裝配到成型的膠體金試紙條內，仿真程度則極高。

使用步驟，

將反應好的試紙條T線顏色與制作的色卡比較，看顏色屬于那一個檔次，則在數據記錄時候填寫該檔次標識。最后做靈敏度比較。

該方法的優點在于使用方便，為肉眼判別設定了比較標準，能轉化為檔次數據。缺點在于人眼對顏色的敏感性差異較大，同一個試紙T線不同的人可能會歸類到不一樣的檔次標準上。數據還是人眼判讀，不適合做為數據證據。于是出現了更好的圖形掃描法。

2、圖形掃描法

該方法使用的資源非常容易解決，普通的掃描儀器就能夠勝任。且能對最后結果做精確的數據分析。

需要的資源，普通掃描儀，能掃描灰度圖象即可。能對灰度線條圖象進行讀數的軟件，試紙條的反應線條和薄層層析的線條實際上是很相似的，所以軟件也可以借用那個領域成熟的產品，有很多例如bandscan,都是免費的。

使用步驟：

將反應好的試紙條放在掃描儀器內，選擇灰度掃描，獲得灰度線條圖象。

然后打開分析軟件，將該灰度圖象導入，自動分析出峰條帶(=可以看出是否有前后帶效應)，峰面積(=靈敏度)，本底情況(=跑板是否干凈)，根據峰面積數值做平行線性分析，就能知道實驗的重復性和獲得回歸曲線。

該方法的優點在于可以把反應信號數據化，并可以作為實驗證據做發表。缺點是操作復雜一些，同時軟件方面現在只能用很多其他領域用的版本，沒有專門針對膠體金試紙版本，不是很方便。 如果有哪位懂編程知識，我可以與你合作開發這個方面的共享軟件，已方便大家使用。

3、讀條儀法

很多廠家都開發了對應的讀條儀，大部分都是采用簡單的30萬象素數碼攝像頭做一個拍攝，然后用軟件分析。做得好的如進口的使用的是cool ccd,干擾少一些，效果好一些，當然價格也貴，意義不大。做得差的如國產的讀條儀用電腦城賣的普通民用數碼攝像頭，80塊一個的成本，對外銷售價格驚人，且還不如用掃描儀來得效果好。

以上是通用讀條儀，也有生產廠家為自己的試紙產品專門定做的讀條儀，那是針對其特定產品使用的，一般不兼容其他試紙，所以不做討論。