間接凝集實驗及致敏紅細胞制備方法

將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關的顆粒載體上，然后與相應的抗體結合，也可出現顆粒載體的凝集現象，稱為間接凝集反應。間接凝集反應比直接凝集反應敏感性為高，可用于微量抗體或抗原的檢查。

一、 間接血球凝集實驗

間接血球凝集實驗是根據紅血球表面的吸附作用而建立起來的。將細菌可溶性抗原提出使之吸附于紅血球表面，此時紅血球即稱為“致敏紅血球”。這種致敏的紅血球具有細菌的抗原性，與相應的抗血清相遇可產生凝集現象。

間接血凝抗原的制備可用加堿或加熱的方法使菌體中的多糖物質浸出，去除類脂以免干擾紅血球的吸附作用。但如系蛋白質時則用來吸附的紅血球需先用鞣酸予以處理。

（一）材料

1、抗原—傷寒桿菌O抗原

2、免疫血清：傷寒桿菌O901免疫兔血清

3、25%綿羊紅血球懸液，生理鹽水，試管吸管等

（二）方法

1、“O”抗原的制備：將每毫升100億的傷寒桿菌“O”菌懸液，置100℃水浴中2小時，離心沉淀吸取上清夜，分裝無菌試管，放4℃冰箱備用。

2、致敏紅血球懸液制備：取一定稀釋度的抗原加等量2.5%綿羊紅血球懸液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分鐘取出振搖一次，共經2小時。然后取出，用生理鹽水洗滌3次，而配制成0.5%懸液即成。

3、實驗步驟：

（1）小試管9只標好號碼于試管架上。

（2）第1管加入0.9毫升生理鹽水，其余各管各加入0.5毫升。

（3）以吸管吸取已加熱滅菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混勻后吸取0.5毫升注入第2管，同樣第2管的血清與鹽水混勻后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀釋直至第8管。自第8管吸出0.5毫升棄去。第9管不加血清作對照。

（4）于每管加入0.5毫升已經致敏的0.5%綿羊紅血球懸液，混勻后放入37℃水浴中2小時后觀察結果。凡最高血清稀釋度的免疫血清試管中呈現完全血凝者，即為該血清的間接血清效價。

二、致敏紅細胞的制備

（一）直接法

1、取10%雙醛固定的紅細胞懸液1ml，離心沉淀后，將壓積細胞懸于0.1mol/L、pH4.0醋酸緩沖液5ml中。

2、預溫后加含適量致敏抗體的醋酸緩沖液5ml，混勻，放37℃20~30min或24℃ 60~75min，其間搖動數次，但不宜劇烈和頻繁搖動，以免引起自凝。

3、最后用0.11mol、pH7.2 PB洗3次。

4、洗滌后的致敏紅細胞用保存液配成10%懸液4℃保存或凍干。臨用前，用實驗中所用血清稀釋液配成0.5%濃度。

（二）間接法1：鞣酸法

1、取壓積紅細胞0.5ml，加0.15mol/L pH7.2 PB至100ml，加入0.05g/L鞣酸液100ml，混勻，放置37℃ 10min。

2、離心沉淀后，用同一緩沖液洗3次，重懸于生理鹽水100ml中。加等量含適量抗原（或抗體）的同一緩沖液，置室溫致敏10min。

3、離心沉淀用1：250稀釋的正常家兔血清洗滌后，制成0.5%的致敏紅細胞懸液。

（三）間接法2：戊二醛一步法

1、將綿羊或人“O”型紅細胞用0.11mol/L pH7.2 PB洗3次，取沉積紅細胞0.1ml，加至含0.1mg抗原或抗體的PB（用于抗原）或pH4.0醋酸緩沖液（用于抗體）2ml中，電磁攪拌下緩慢滴加2.5%戊二醛0.25ml。

2、繼續于室溫攪拌2h后，用PB洗3次，然后用稀釋液20ml配成0.5%致敏紅細胞懸液。

（四）間接法3：戊二醛二步法

1、將綿羊紅細胞用0.11mol/L pH7.2 PB洗5次，用1%戊二醛配成2%懸液，于4℃醛化30min。

2、醛化完畢，用PB洗5次，用pH4.0醋酸緩沖液（或pH7.2 PB）配成5%懸液。取此懸液10份，加入6份用pH7.2 PB配制的抗原溶液（抗原濃度預測定）或用pH4.0醋酸緩沖液配制的抗體溶液（IgG約200μg/ml）。

3、37℃水浴1h，時時搖動，取出后用PB洗2次，用稀釋液配成0.5~1%懸液。醛化紅細胞如不立即致敏，4℃可保存2個半月，致敏紅細胞可保存3個月。

（五）間接法4：CrCl3法

1、取洗過5次的2%紅細胞懸液10ml，加入0.2ml抗原（或抗體）溶液，混合后在電磁攪拌下緩慢滴入最適濃度的CrCl3溶液，置室溫5min，其間搖動1~2次。

2、加入等體積PB中止反應，用PB洗2次后配成0.5%~0.75%細胞懸液。

（六）間接法5：雙偶氮聯苯胺（BDB）法

1、取含適量抗原或抗體的0.15mol/L pH7.2 PB 3ml，加50%醛化固定的紅細胞0.1ml，混勻。

2、加BDB應用液1ml，混勻放室溫15min，4℃離心，用PB洗2次，用含1%兔血清的生理鹽水配成1%紅細胞懸液。