實驗1 顯微鏡

實驗1 顯微鏡

　　一、目的

　　了解顯微鏡的基本構造，初步掌握顯微鏡的使用方法。

　　二、內容

　　（一）觀察顯微鏡的各部分結構，理解其基本性能。

　　（二）通過字母片和粉蝶鱗片的觀察，學習使用顯微鏡的方法。

　　（三）初步認識幾種類型的顯微鏡。

　　三、實驗材料和用具

　　學生用顯微鏡、幾種不同類型的顯微鏡。

　　載玻片、蓋玻片、字母片、50％酒精、粉蝶、毛筆。

　　顯微鏡是觀察研究細胞、組織以及原生動物等必需的儀器，由于顯微鏡的發展日新月異，而我國各高校教學實驗室的設備水平不等，因此我們在此仍以簡單的單筒目鏡和雙筒目鏡復式顯微鏡為主，再輔以標準的實驗室顯微鏡。

　　四、實驗操作及觀察

　　必須按實驗指導了解顯微鏡的各部分結構、性能及使用方法。切不可脫離實驗指導，擅自扭動各部件，以免損壞儀器。

　　使用顯微鏡作一般觀察主要是學會調亮度、調焦點。作顯微照相時，還必須調中心（調聚光器中心）。

　　使用高倍鏡時，一定要從低倍鏡開始。用油鏡時要從40×的物鏡開始。將要觀察的標本某部分移至視野正中央。在高倍鏡下只能用細調焦器調焦點，不能用粗調焦器。要開大光闌。

　　（一）顯微鏡的基本結構：顯微鏡的中部有一彎曲的柄，稱鏡臂，基部為鏡座。用右手握緊鏡臂，將其自鏡箱（或鏡柜）中取出，左手托住鏡座，保持鏡體直立，輕放于桌上，觀察各部分構造。

　　鏡座上的短柱叫鏡柱。鏡座與鏡柱之間有一傾斜關節（在較新的顯微鏡無此傾斜關節），可使顯微鏡在90°角范圍內隨意傾斜成任何角度。

　　在鏡臂基部有一個方形或圓形的平臺，是載物臺（或稱鏡臺）。臺的中央有一圓孔，可通過光線。兩側有壓片夾，用以固定玻片標本。現代的顯微鏡具鏡臺X－Y驅動器，用以固定和移動玻片標本。在圓孔的下面，有由一片或數片透鏡所組成的聚光器，有集射光線于物體的作用。聚光器附有一組由金屬片組成的可變光闌，其側面伸出一杠桿，可前后移動使光闌開閉。光闌開大則光線較強，適于觀察色深的物體；光闌縮小則光線較弱，適于觀察透明（或無色）的物體。

　　在聚光器下方有反光鏡，可將光線反射至聚光器。此鏡一面平，一面凹。凹面具有較強的反光性，多用于光線較暗的情況下；光線較強時用平面鏡即可。內光源顯微鏡的光源位于鏡座靠后方，在鏡座右側有光源按鈕，此按鈕可前后移動，使光闌開閉，用以調節光線的強弱。

　　在載物臺的圓孔上方，有一附于鏡柄上端的圓筒稱為鏡筒，其上下兩端附有鏡頭。顯微鏡如具有抽筒，則在觀察物體之前，一般應抽至160mm處。現代的顯微鏡一般有兩個鏡筒。兩鏡筒之間的距離，可按觀察者雙目的距離調節。

　　鏡筒上端有接目鏡（或稱目鏡），可從鏡筒內抽出。接目鏡有低倍和高倍之分。

　　在鏡筒下端有可旋轉的圓盤叫旋轉器，下面附有2～4個接物鏡（或稱物鏡）以螺旋旋入旋轉器內。接物鏡也有低倍和高倍之分。轉動旋轉器可換用接物鏡。

　　在鏡臂上有兩組螺旋。大的叫粗調焦器，小的叫細調焦器。現代的顯微鏡粗、細調焦器常組合在一起，外周粗的螺旋為粗調焦器，中央細的為細調焦器。用調焦器調焦點。粗調焦器升降鏡筒較快，用于低倍鏡調焦；細調焦器升降鏡筒較慢，用于高倍鏡調焦。

　　接物鏡有低倍和高倍之分。較短的是低倍，一般放大10倍（10×）；較長的是高倍，一般放大40倍（40×）、45倍（45×）或60倍（60×）。油物鏡放大90倍（90×）或者100倍（100×）。接目鏡也有高低倍之分，較長的是低倍，一般放大5倍（5×）或6倍（6×），較短的是高倍，一般放大10倍（10×）、12倍（12×）或15倍（15×）。

　　顯微鏡的總放大倍數是接目鏡的放大倍數與接物鏡放大倍數的乘積。例如，使用5×接目鏡與10×接物鏡，則總放大倍數是50倍。使用10×接目鏡與40×接物鏡，則總放大倍數是

　　（二）顯微鏡的使用方法：使鏡臂向著自己（現代顯微鏡使鏡臂反向對著自己），擺好顯微鏡。轉動粗調焦器，把鏡筒向上提起。轉動旋轉器，使低倍接物鏡對準載物臺的圓孔。二者相距約2cm左右，兩眼對著雙筒接目鏡觀察（如為單筒目鏡，則兩眼睜開，用左眼看）。打開可變光闌，用手轉動反光鏡，使它正對著光源，但不可對直射的陽光。當視野（即從鏡內看到的圓形部分）呈現一片均勻的白色時即可。如為內光源顯微鏡，打開光源按鈕，向前向后移動按鈕，調節光線的強弱至適宜強度。

　　取一拉丁字母裝片放載物臺上，使字母正對中央圓孔。用壓片夾（或X－Y驅動器）固定。轉動粗調焦器，使鏡筒下降至低倍接物鏡距裝片5mm左右為度。然后自目鏡觀察，同時轉動粗調焦器，提升鏡筒，至視野內的字母清晰為止，此為調焦點。再以可變光闌調節亮度至適宜強度。一般現代顯微鏡由粗、細調焦器提高或降低鏡臺一鏡臺下聚光器。

　　注意視野內看到的字母，上下左右輕輕移動裝片，物像的移動方向如何？思考一下原因。

　　低倍物鏡觀察畢可轉高倍物鏡。首先將要詳細看的部分移到視野正中央，提升鏡筒，轉動旋轉盤，換高倍物鏡。從側面觀察下降鏡筒，使高倍物鏡幾乎接觸玻片（1mm左右）為止。再從目鏡觀察，轉動細調焦器，提升鏡筒，一般旋轉半圈至一圈即可出現物像（要小心操作，切勿壓破蓋玻片或載玻片）。可將光闌開大，上下調節細調焦器，使物像達到最清晰為止。現代顯微鏡一般在低倍物鏡下調好焦點后，可直接轉換高倍物鏡。注意在高倍物鏡下，視野內的字母能看到多大部分？與低倍物鏡所見比較一下。

　　使用高倍物鏡時，一定先從低倍物鏡開始（如上步驟）。準備詳細觀察的標本部分，要移到視野正中央。在高倍物鏡下調焦點只能用細調焦器，不能用粗調焦器。光闌要開大。

　　由低倍物鏡轉高倍物鏡需多練習幾次，要初步掌握使用方法。

　　觀察粉蝶鱗片：用毛筆在粉蝶的翅上刷幾下，在載玻片中央涂一涂，即有一些粉狀物附于載玻片上，此即鱗片。于其上加一滴50％酒精。用鑷子另取一干凈蓋玻片，先使蓋玻片一邊接觸酒精，再輕輕放下，勿使蓋玻片與載玻片間留有氣泡，或使酒精逸出過多（這是臨時裝片的作法）。做好裝片后在低倍物鏡下觀察，再轉高倍物鏡觀察。粉蝶鱗片是什么形狀？

　　觀察完畢后，必須先把接物鏡頭轉開，然后取出玻片標本。每次實驗完畢后，都要把高、低倍接物鏡轉向前方，不可使接物鏡正對著聚光器，然后放回鏡箱（或鏡柜）內。

　　要注意經常保持顯微鏡的清潔。如金屬部分有灰塵時，一定要用清潔的軟布擦干凈。如鏡頭有灰塵時，必須用特備的擦鏡紙輕輕地擦去。切勿用手或其他布、紙等擦拭，以免損壞透鏡。

　　（三）標準實驗室顯微鏡：圖1-1所示為一種裝配較完全的標準實驗室顯微鏡（standardlaboratory microscope）剖面結構圖。可按該顯微鏡的圖注及其結構說明認識顯微鏡各部分結構，并想想各組成結構的功能。

　　標準實驗室顯微鏡的結構（結合圖1－1）說明：

　　光源（light source，L）：可以為一低電壓的燈泡或為一較復雜的光源。

　　光源聚光器（lamp condenser，LC）：它將光源的像投射到孔徑光闌的平面。

　　場光闌（field diaphragm，FD）：光闌的大小可調節，光闌限制光線照射到物體的面積。

　　鏡臺下聚光器（substage condenser，SC）：它將場光闌成像于物體平面。通常聚光器由兩個調中心螺旋（centering screws，CS）調中心，由聚光器旋鈕（condenser knob，K）通過齒軌上下移動調節焦點。

　　聚光器前透鏡（front lens of the condenser，FL）：為鄰近物體的透鏡，用透鏡旋鈕（lensknob，LK）能將FL移出光路。在聚光器上可附有濾光器支架（filter carriers，FC）。

　　鏡臺下光闌（或孔徑光闌，substage diaphragm or aperture diaphragm，AD）形成鏡臺下聚光器的入射光瞳（entrance pupil），并限制其數值孔徑。用光闌桿（diaphragm lever，DL）調節該光闌的大小。縮小光闌可增加景深（depth of field），減小球面像差（sphericalaberration），并產生干涉條紋（interference fringes）增加反差，降低最后像的細節的可見度。

　　油浸聚光器（oil immersion condenser）：其上有OIL或OEL字樣，它比干聚光器有較高的數值孔徑。用時在前透鏡和物體之間需加一層具一定折射率的油。

　　鏡臺（stage，ST）：轉動鏡臺驅動器（stage drives，SD）旋鈕可使鏡臺在X—Y方向移動。

　　粗、細調焦器（coarse and fine focusing knobs，FK）：大部分現代顯微鏡由粗、細調焦器提高和降低整個鏡臺—鏡臺下聚光器。在較老的顯微鏡，由粗、細調焦器調節鏡筒使其提高與降低。

　　接物鏡（objective lenses，OL）（或稱物鏡）：它們投射物體放大的像到位于目鏡中的中間像平面（intermediate image plane）。3個或更多的物鏡可裝在一個能旋轉的轉換器上。物鏡不同程度地校正了透鏡的像差。消色差（achromats）是校正兩種顏色，通常是藍和紅。復消色差（apochromats）是完全校正3種色（藍、綠、紅）。Plano物鏡和相似標志的透鏡是校正視場的曲率（curvature）失真。這些特別適用于照相。在接物鏡鏡筒上常見有PL25／0.50字樣。“PL”表明這種透鏡是特別校正的，產生平場（flat field）。這樣高度校正的物鏡必須與標示的補償目鏡合用，才能獲得完全校正的效果。“25”表示中間像的放大，“0.50”表示數值孔徑（numerical aperture，NA）。干透鏡的 NA小于1（在g干透鏡和標本之間有空氣分開）。在油浸透鏡能達到1.4。油浸透鏡（oil immersion lenses）或稱油物鏡，在其鏡筒上有OIL或OEL字樣，其NA值可達1.4。使用時，在前透鏡和標本之間必須加一層具一定折射率的液體油。否則，就干擾其校正并減低其NA。浸油與組織學制片所用的蓋片有相似的折射率。光線經物體通過相近折射率的介質到達物鏡。用油物鏡時，蓋玻片與前透鏡之間的工作距離最短。如果蓋片太厚則不能調焦點，現代高級物鏡裝有彈簧，物鏡與蓋片接觸可不致損壞。

　　接目鏡（ocular或eyepiece，O）或稱目鏡：它的作用是作為一個由物鏡所產生的中間像的放大器。前透鏡是主要的放大部件。向場透鏡（field lens）能使更多的光線進入目鏡。光闌位于前透鏡的焦平面，是物鏡形成中間像的位置。出射光瞳或目點 （exit pupil or eye point）是離開目鏡的光錐最窄的部分。正確的位置，觀察者的瞳孔與目點重合一致。高目點（high-eye point）目鏡，戴眼鏡者可直接進行觀察。在高度校正的顯微鏡，目鏡必須與特定的物鏡配合使用以達到所要求的校正效果。

　　標準實驗室顯微鏡的使用方法：作為一般觀察與上述的使用方法基本相同。在條件較好的實驗室，學生可根據上述的（二）顯微鏡使用方法，結合標準實驗室顯微鏡的結構說明，自己操作使用。如果需要觀察細胞組織的某些微細結構，可使用油物鏡進一步放大觀察。

　　油物鏡的使用：首先在高倍于物鏡（40×）下調準焦點，將要觀察的標本某部分移至視野的正中心。然后，轉動旋轉器移開物鏡，在蓋片上視野中央的位置加一滴鏡頭油（具一定折射率的），再將油物鏡移至該處，使前透鏡與油滴接觸。開大光闌，即可看到物像，上下稍動細調焦器則可看到清晰的物像。用后，將油物鏡移至旁邊，將最低倍物鏡移至玻片標本上方，不宜將高倍物鏡（40×）放在此處，以免玷污透鏡。然后，用擦鏡頭紙沾鏡頭清洗液輕輕擦拭透鏡。不宜用二甲苯或相似溶劑擦拭，以免損壞透鏡中的膠合劑。

　　五、示范

　　顯微鏡有許多類型和型號，各有其不同的用途。根據實驗室的條件，可示范或演示幾種常用的新型顯微鏡。如果條件不夠，可參看圖1－2。

　　（一）實體顯微鏡或稱立體顯微鏡（stereo microscope）：這種顯微鏡因可觀察不透明物體表面的立體結構而得名。它具有多種形式的外加光源照明器，也有鏡體內同軸垂直照明，使光線落射到所觀察的物體上。還有兼具透射光照明器、熒光照明器和許多其他照明系統，擴大了使用范圍。對可變焦距立體顯微鏡（zoom stero microscope）（Olympus生產的齊焦透鏡，parfocal lenses）裝在轉換器上的兩物鏡使能快速連續地進行觀察。一般放大倍數較低。新型的實體顯微鏡在向高分辨、高放大倍數發展。如SZX12鏡總放大范圍為2．1～675×（圖1-2A）。

　　（二）暗視野顯微鏡（darkfield microscope）：其外形結構與普通顯微鏡一致。最主要的不同點是聚光器。由光源來的光線經過聚光器使光束經過物體落在物鏡前透鏡的外邊。因此視野是黑暗的，通過物體本身的光反射和折射的光進入物鏡形成亮的像，即標本在暗的背景上呈現出發亮的圖像。這種顯微鏡適于觀察具較大反射率、不同折射率或較透明的細胞組織切片或裝片標本。

　　（三）相差顯微鏡（phase contrast microscope）：這種顯微鏡有具環形光闌（ring shaped“annular”diaphragm）的相差聚光器（phasecontrastcondenser）、相差物鏡（phasecontrast圖1—2幾種新型的顯微鏡照片（自Olympus公司）objective，在鏡筒上有“Ph”字）和相板（phase plate）。它主要是利用折射率的差異（如存在于相物體的）以形成亮／暗反差。光線經過具環形光闌的相差聚光器、物體、相差物鏡，將光束分為兩部分，一部分是物體結構的折射光，另一部分不受物體影響的光，經過相板二者干涉，形成干涉圖像，由于兩束光的相移位接近λ／2（半波長），可見反差分明的圖像。適于觀察較透明的或染色反差小的細胞組織切片或裝片。

　　（四）熒光顯微鏡（fluorescence microscope）（圖1－2B）：熒光來自于特定波長光輻射作用所激發的較高能級的電子躍遷而放出的一些具特定能量的光子（photon）（波長比激發光長）。例如，廣泛應用的熒光染料其最大的激發光為490nm，而其發射光最大約為530nm。少數物質如葉綠素具固有的熒光（初級熒光），大部分生物材料需用熒光染料染色后，才顯示出熒光，此為次級熒光。現代的顯微鏡使用入射光型（incident light mode），物鏡用作為照明和物體觀察。入射光型對激發作用和收集發射光是最有效的。熒光顯微鏡能鑒定極少量的熒光物質，通過選擇濾光器能高度特異地鑒定一定的熒光染料。大量的組織化學、免疫細胞化學方法用熒光染料選擇物質特異性染色，具有很高的敏感性和特殊性。

　　（五）倒置顯微鏡（inverted microscope）：與標準實驗室顯微鏡表面上似無相似性，但實際，其組成部件和功能是一致的。只是聚光器倒過來在鏡臺之上，物鏡在鏡臺之下（圖1-2C）。工作距離較大，適于觀察研究組織培養的細胞。

　　（六）研究用大型的顯微鏡，也有不同類型和型號，其中萬能顯微鏡除具普通顯微鏡的功能外，還具有相差、暗視野、熒光、偏振光等顯微鏡的附件及功能（圖1—2D）。

　　（七）有條件的實驗室，可參觀電子顯微鏡（electron microscope，EM），包括掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）和透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）。

　　六、