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第五篇　實驗技術

第二十一章　寄生蟲學實驗技術

第一節　寄生蟲學實驗診斷技術

一、病原檢查

（一）糞便檢查

糞便檢查是診斷寄生蟲病常用的方法。要取得準確的結果，糞便必須新鮮，送檢時間一般不宜超過24小時。如檢查腸內原蟲滋養體，最好立即檢查。盛糞便的容器要干凈，并防止污染與干燥；糞便不可混雜尿液等，以免影響檢查結果。

1．直接涂片法　用以檢查蠕蟲卵、原蟲的包囊和滋養體。方法簡便，連續作3次涂片，可提高檢出率。

⑴蠕蟲卵檢查：滴一滴生理鹽水于潔凈的載玻片，用棉簽棍或牙簽挑取綠豆大小的糞便塊，在生理鹽水中涂抹均勻；涂片的厚度以透過涂片約可辨認書上的字跡為宜。一般在低倍鏡下檢查，如用高倍鏡觀察，需加蓋片。應注意蟲卵與糞便中異物的鑒別。蟲卵都具有一定形狀和大小；卵殼表面光滑整齊，具固有色澤；卵內含卵細胞或幼蟲。

⑵原蟲檢查：

1）活滋養體檢查：涂片應較薄，方法同查蠕蟲卵。氣溫愈接近體溫，滋養體的活動愈明顯。必要時可用保溫臺保持溫度。

2）包囊的碘液染色檢查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理鹽水。如碘液過多，可用吸水紙從蓋片邊緣吸去過多的液體。若同時需檢查活滋養體，可在用生理鹽水涂勻的糞滴附近滴一滴碘液，取少許糞便在碘液中涂勻，再蓋上蓋片（圖21－1）。涂片染色的一半查包囊；末染色的一半查活滋養體。

圖21－1　原蟲包囊碘液染色操作方法

碘液配方：碘化鉀4g，碘2g，蒸餾水100ml。

3）隱孢子蟲卵囊染色檢查：目前較佳的方法為金胺酚改良抗酸染色法。對于新鮮糞便或經10％福爾馬林固定保存（4℃1個月內）的含卵囊糞便都可用此法染色。染色過程是先用金胺－酚染色，再用改良抗酸染色法復染。方法步驟如下：

金胺－酚染色法：

①染液配制：1g／L金胺－酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石碳酸5.0g，蒸餾水100ml；3％鹽酸酒精（第二液）：鹽酸3ml，95％酒精100ml；5g／L高錳酸鉀液（第三液）：高錳酸鉀0.5g，蒸餾水100ml。

②染色步驟：滴加第一液于晾干的糞膜上，10～15分鐘后水洗；滴加第二液，1分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置熒光顯微鏡檢查。

低倍熒光鏡下，可見卵囊為一圓形小亮點，發現乳白色熒光。高倍鏡下卵囊呈乳白或略帶綠色，卵囊壁為一薄層，多數卵囊周圍深染，中央淡染，似環狀，或深染結構偏位，有些卵囊全部為深染。但有些標本可出現非特異的熒光顆粒，應注意鑒別。

改良抗酸染色法：

①染液配制：石炭酸復紅染色液（第一液）：堿性復紅4g,　 95％酒精20ml，石炭酸8ml，蒸餾水100ml；10％硫酸溶液（第二液）：純硫酸10ml，蒸餾水90ml（邊攪拌邊將硫酸徐徐傾入水中；20g／L孔雀綠液（第三液）：20g／L孔雀綠原液1ml，蒸餾水10ml。

②染色步驟：滴加第一液于糞膜上，1.5～10分鐘后水洗；滴加第二液，1～10分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置顯微鏡下觀察。

經染色后，卵囊為玫瑰紅色，子孢子呈月牙形，共4個。其他非特異顆粒則染成藍黑色，容易與卵囊區分。

不具備熒光鏡的實驗室，亦可用上述方法先后染色，然后在光鏡低、高倍下過篩檢查，發現小紅點再用油鏡觀察。效果好，可提高檢出速度和準確性。

2．厚涂片透明法（改良加藤法）取約5mg（已用100目不銹鋼篩除去糞渣）糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘油－孔雀綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開（20×25mm）。置于30～36℃溫箱中約半小時或25℃約1小時。待糞膜稍干，即可鏡檢。

玻璃紙準備：將玻璃紙剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油－孔雀綠溶液（含純甘油100ml、水100ml和3％孔雀綠1ml的水溶液）中，至少浸泡24小時，至玻璃紙呈現綠色。

使用此法需掌握糞膜的合適厚度和透明的時間。如糞膜厚，透明時間短，蟲卵難以發現；如透明時間過長，則蟲卵變形，也不易辨認。

3．濃聚法

⑴沉淀法：原蟲包囊和蠕蟲卵的比重大可沉集于水底，有助于提高檢出率。但比重較小的鉤蟲卵和某些原蟲包囊則效果較差。

1）重力沉淀法：取糞便20～30g、加水成混懸液，經金屬篩（40～60孔）或2、3層濕紗布過濾，再加清水沖洗殘渣；過濾糞液在容器中靜置25分鐘，倒去上液，重新加滿清水，以后每隔15～20分鐘換水一次（3～4次），直至上液清晰為止。最后倒去上液，取沉渣作涂片鏡檢。如檢查包囊，換水間隔時間宜延長至約6小時換一次（圖21－2）。

圖21－2　糞便沉淀及毛蚴孵化法

2）離心沉淀法：將上述濾去粗渣的糞液離心（1500～2000rpm/min）1～2分鐘，倒去上液，注入清水，再離心沉淀，如此反復沉淀3～4次，直至上液澄清為止，最后倒去上液，取沉渣鏡檢。

3）汞碘醛離心（MIFC）沉淀法：糞便1g，加適量（約10ml）汞碘醛液，充分調勻，用2層脫脂紗布過濾，再加入乙醚4ml，搖2分鐘，離心（2000rpm/min）1～2分鐘，即分成乙醚、糞渣、汞碘醛及沉淀物4層。吸棄上面3層，取沉渣鏡檢。

汞碘醛配制：

　　①汞醛（MF）液：1／1000硫柳汞酊200ml，甲醛（40％）25ml，甘油50ml，蒸餾水200ml。 ②盧戈氏液：碘5g，碘化鉀10g，蒸餾水100ml。

檢查時取汞醛液2.35ml及5％盧戈氏液0.15ml混合備用。但混合液在8小時后即變質，不應再用；碘液亦不這且于1周后再用。

4）醛醚沉淀法：置糞便1～2g于小容器內，加水10～20ml調勻，將糞便混懸液經2層紗布（或100目金屬篩網）過濾，離心（2000rpm/min）2分鐘；倒去上層糞液，保留沉渣，加水10ml混勻，離心2分鐘；倒去上液，加10％甲醛7ml。5分鐘后加乙醚3ml，塞緊管口并充分搖勻，取下管口塞，離心2分鐘，即可見管內自下而上分為4層。取管底沉渣涂片鏡檢。如檢查原蟲包囊，可加盧戈氏液染色，加蓋片鏡檢。

⑵浮聚法：利用比重較大的液體，使原蟲包囊或蠕蟲卵上浮，集中于液體表面。常用的方法有兩種：

1）飽和鹽水浮聚法：此法用以檢查鉤蟲卵效果最好。用竹簽取黃豆粒大小的糞便置于浮聚瓶（高3.5cm，直徑約2cm的圓形直筒瓶）中，加入少量飽和鹽水調勻，再慢慢加入飽和鹽水到液面略高于瓶口，但不溢出為止。此時在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15分鐘后，將載玻片提起并迅速翻轉，鏡檢（圖21－3）。

圖21－3　飽和鹽水浮聚法

飽和鹽水配制：將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內，不斷攪動，直至食鹽不再溶解為止。

2）硫酸鋅離心浮聚法：此法可用于檢查原蟲包囊，球蟲卵囊和蠕蟲卵。取糞便約1g，加10～15倍的水，充分攪碎，按離心沉淀法過濾，反復離心3～4次，至水清為止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸鋅液（33％的溶液），調勻后再加硫酸鋅溶液至距管口約1cm處，離心1分鐘。用金屬環取表面的糞液置于載玻片上，加碘液一滴，鏡檢。

3）蔗糖離心浮聚法：此法適用于檢查糞便中隱孢子蟲的卵囊。取糞便約5g，加水15～20ml，以260目尼龍袋或4層紗布過濾。取濾液離心5～10分鐘，吸棄上清液，加蔗糖溶液（蔗糖500g，蒸餾水320ml，石炭酸6.5ml）再離心，然后如同飽和鹽水浮聚法，取其表液膜鏡檢（高倍或油鏡）。卵囊透明無色，囊壁光滑，內有一小暗點和發出淡黃色的子孢子。隱孢子蟲的卵囊在漂浮液中浮力較大，常緊貼于蓋片之下，但1小時后卵囊脫水變形不易辨認，故應立即鏡檢。也可用飽和硫酸鋅溶液或飽和鹽水替代蔗糖溶液。

常見蠕蟲卵、包囊的比重如表21－1。

表21－1　蠕蟲卵及包囊的比重

蟲卵或包囊 比 重 華支睪吸蟲卵 1.170～1.190 姜片吸蟲卵 1.190 肝片形吸蟲卵 1.200 日本血吸蟲卵 1.200 帶絳蟲卵 1.140 微小膜殼絳蟲卵 1.050