PCR 擴增模板和抗體可變區基因的擴增 ? ??? 如果構建Fab抗體庫,必需利用RT-PCR獲取抗體基因;構建ScFv抗體庫,既可以DNA作模板,也可以cDNA作模板。本室在構建小鼠ScFv抗體庫過程中,主要采用DNA作為擴增模板。 ? 【材料和試劑】 （1）PCR儀 （2）Taq酶 （3）氯仿 （4）瓊脂糖 ? 【操作步驟】 ?（1）在200μl離心管中混勻下列成分： ??? 模板DNA???????? 5μg ??? 10×PCR緩沖液?? 10μl(含25mmol/L MgCl2) ??? 5’引物???? ?????20pmol ??? 3’引物????????? 20pmol ??? Taq酶?????????? 5U,加超純水至100μl,石蠟油1滴。 ?（2）93℃預變性2min,然后94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1.5min,反應進行30個循環后,再72℃延伸10min； ?（3）將反應物冷卻至室溫，用等體積氯仿抽提去掉石蠟油,水相轉移到一個干凈的離心管中,取5μl在1.5％的瓊脂凝膠上電泳，觀察擴增產物大小,重鏈產物在370～390bp左右,輕鏈產物在340～360bp之間。 ?（4）利用PAGE或瓊脂糖凝膠電泳回收合適大小的DNA條帶。當采用瓊脂糖凝膠電泳回收時,不能使用Bio101公司的Geneclean Kit回收,該產品只適于回收大于500bp的DNA片段。而Promega公司的WizardTM PCR純化kit的回收效率在80％以上。 在PCR擴增中要將5’端引物與3’端引物逐一配對,工作量較大。采用混合引物或簡并引物擴增可以減少配對擴增的數目,但效果并不總是十分理想。