油菜RNA的提取方法

1.取新鮮植物葉片0.1g(研磨樣品前可用水或酒精清洗樣品)于2mL離心管中，在液氮或-80℃下貯存。 2.研磨： 在樣品研磨前，提取液[飽和酚︰(0.1mol·L-1LiCl、100mmol·L-1 Tris-HCl PH8.0、10mmol·L-1 EDTA、1%SDS)=1︰1]于80℃浴預熱，加入前，提取混合液上下顛倒混勻。 3.提取： （1） 加入500μL80 提取液，30s渦流混勻； （2） 加入250μL氯仿︰異戊醇（24︰1），30s渦流混勻； （3） 置于冰上。 4.沉淀： （1） 離心：12000rpm，4℃，5min。 （2） 預處理：300μL的4M LiCl（相當提取液的一半）。 （3） 取樣品水相與LiCl 按1︰1混合（如溶液混濁可再離心）。 （4） 沉淀：混合液于-20過夜。 （5） 收集：12000rpm，4℃，15min。 5.分離： （1） 棄上清，可剩余少量殘留， （2） 加100μL的DEPC水，用吸管上下混勻溶解沉淀。 （3） 加入10μL的3 mol·L-1 NaAc(pH5.2)和200μL的95%乙醇。輕緩渦流幾秒，RNA儲于-20℃或-70℃過夜。 6.洗滌： （1） 12000rpm，4℃，15min， 棄上清。 （2） RNA沉淀用70%乙醇洗滌，12000rpm，4℃，5min后輕棄上清，旋轉吸取液體。 （3） RNA于通風櫥放置15min風干，并確保無水進入。 7.懸浮： 12μL的DEPC水溶解沉淀，儲于-20℃或-70℃。 RNA提取完成后，利用瓊脂糖凝膠檢測RNA質量。 瓊脂糖變性膠的制備：2.4g瓊脂糖，150mL水，20mL的10×mops緩慢加熱至沸（小心溢出）。冷卻至50℃，加入30mL甲醛，總量200mL。 樣品處理： (1)、2μL RNA懸浮液（0.5μg·μL-1）； (2)、3μL 變性緩沖液（10×mops︰甲醛：甲酰胺=1︰1.5︰5）； (3)、0.6μL LB（1mmol·L-1 EDTA pH8.0 ，50%甘油，0.25%溴酚藍，0.25%混二甲苯）。 混合后置于65℃干浴5min后于冰上。 上樣混合液按①︰②︰③＝1︰1.5︰0.3比例混合。 1μL的RNA上樣混合液可在加熱前/后加入，電解液為1×mops，并且高于稍膠面，電壓小于500mA。