In vitro A. . 化學合成法 Ｂ、體外轉錄 Ｃ、酶切長鏈dsRNA In vivo Ｄ、載體表達siRNA Ｅ、PCR合成siRNA表達元件

A. 化學合成法 1.方法簡單、快速，需要時間短；獲得的siRNA純度高 2.適用于短期體外實驗研究，尤其適用于需要單一siRNA序列的研究 3.siRNA可進行標記 4.需要進行大規模的篩選來確定單一的siRNA序列 5.不適用于長期研究 6.不適用于siRNA序列的篩選

siRNA序列設計注意事項 1.選擇以AA開頭的19-21nt長的序列 2.靶定序列從起始密碼子下游75-100個nt處開始，到終止密碼子上游75-100nt處結束 3.選擇 2-4個靶定序列，以篩選特異性最好的進行實驗 4.選擇的序列中 GC含量在 30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出現3 個以上G。 5.若需要發卡結構，發卡部分長度一般為6-9nt，有文獻報道9nt效果較好. 6.最后,選擇的DNA 片段經BLAST 查詢,應與其它人類基因無同源性 7.設定適當的對照

設置適當的siRNA對照 1) 與靶定siRNA有相同的堿基組成，但排列完全不同，且不與其它基因由同源性 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6) ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6) 2)1-2堿基錯配的 siRNA對照 (1-2nt) AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG T 和 A錯配

siRNA序列設計 根據文獻報道，使用確定的siRNA序列 許多網站提供siRNA設計軟件，只需輸入靶定基因序列，即可提供候選siRNA序列；比如Ambion公司,武漢晶賽

B、體外轉錄合成短的siRNA 1.T7 RNA 聚和酶體外轉錄DNA，直接產生小片斷的siRNA， 2.快速、靈活，適用于siRNA序列的篩選以及化學合成siRNA價格昂貴時 3.siRNA可進行標記 4.可重復性差，不適用于長期研究和需要大量單一siRNA序列的研究 ( 使用 T7 RNA 聚合酶需要轉錄的RNA前兩個核苷酸為GG or GA 以保證高的合成效率 (Milligan 1987). 在siRNA的5‘ 需要是GG or GA 序列，同時在3’端又需要有兩個UU ；這就極大的減少了可能的siRNA的靶位點 這些限制了體外轉錄作為產生siRNAs穩定的方式) (體外合成一段目的基因的寡核苷酸（有義鏈和反義鏈），其3‘端含有8個堿基與Ｔ７啟動子序列互補；將Ｔ７啟動子與模板混合，Ｋｌｅｎｏｗ酶補平，使用Ｔ７ＲＮＡ酶進行轉錄。雜交，消化、純化 )

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