Northern Blot實驗方法
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[ 儀器 、試劑、材料] (一) 儀器 恒溫水浴箱,電泳儀,凝膠成像系統,真空轉移儀,真空泵,UV 交聯儀,雜交爐,恒溫搖床,脫色搖床,漩渦振蕩器,分光光度計,微量移液器,電爐(或微波爐),離心管,燒杯,量筒,三角瓶,等。 (二)材料 總RNA樣品或mRNA樣品,探針模板DNA(25 ng),尼龍膜 (三) 試劑 NorthernMax Kit(Cat. # 1940,Ambion, Inc.),瓊脂糖,DEPC, X光底片,底片暗盒,Random Primer, dNTP Mixture,111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,雙氧水, 滅菌水等。 [方法與步驟] 1. 用具的準備: 180度烤器皿:三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。 電泳槽:清洗梳子和電泳槽,并用雙氧水浸泡過夜,用DEPC水沖洗,干燥備用。 處理DEPC水(2 L)備用。 2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染 用RNAZap擦洗梳子,電泳槽,刀片等,然后用DEPC水沖洗二次,去除RNAZap。 3.制膠: 1. 稱取0.36mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中,加入32.4mlDEPC水后,微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補充蒸發的水分) 2. 在通風廚中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer,輕輕振蕩混勻。 注意盡量避免產生氣泡。 3. 將熔膠倒入制膠板中,插上梳子 如果膠溶液上存在氣泡,可以用熱的玻璃棒或其它方法去除,或將氣泡推到膠的邊緣。注:膠的厚度不能超過0.5cm。 4.膠在室溫下完全凝固后,將膠轉移到電泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm,小心拔出梳子。(配制250ml 1*MOPS Gel Running buffer,在電泳過程中補充蒸發的buffer。) 5.檢查點樣孔。 4. RNA樣品的制備 在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當的EB(終濃度為10ug/ml)。混勻后,65℃空氣浴15min。短暫低速離心后,立即放置于冰上5min。 5. 電泳: 1. 將RNA樣品小心加到點樣孔中。 2. 在5V/cm下跑膠(5x14cm)。在電泳過程中,每隔30min短暫停止電泳,取出膠,混勻兩極的電泳液后繼續電泳。當膠中的溴紛藍(500bp)接近膠的邊緣時終止電泳。 3. 紫外燈下,檢驗電泳情況,并用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點樣孔的距離。 注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。 6. 轉膜 1.用3%雙氧水浸泡真空轉移儀后,用DEPC水沖洗。 2.用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏,用DEPC水沖洗二次。 3.連接真空泵和真空轉移儀,剪取一塊適當大小的膜(膜的四邊緣應大于塑膠屏孔口的5mm),膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后,放置在多孔滲水屏的適當位置。 4.蓋上塑膠屏,蓋上外框,扣上鎖。 5.將膠的多余部分切除,切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔,并至少蓋過邊緣約2mm,以防止漏氣。 6.將膠小心放置在膜的上面,膜與膠之間不能有氣泡。 7.打開真空泵,使壓強維持在50~58mbar;立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10min在膠面加上1ml transfer buffer,真空轉移2小時。 8.轉膜后,用鑷子夾住膜,于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒,去除殘余的膠和鹽。 9.用吸水紙吸取膜上多余的液體后,將膜置于UV交聯儀中自動交聯。 10.將膠和紫外交聯后的膜,在紫外燈下檢測轉移效率。(避免太長的紫外曝光時間) 12.將膜在-20℃保存。
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