Annexin-V-FLUOS和PI雙標記法檢測細胞凋亡

Annexin-V-FLUOS 和PI雙標記法檢測細胞凋亡 ? ??? 凋亡早期，細胞表面可發生改變，細胞膜的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從胞膜內轉移到胞膜外層，從而使PS暴露在細胞表面。在凋亡發生時，巨噬細胞能特異性識別暴露在細胞表面的PS，從而吞噬凋亡細胞和凋亡小體，使機體免于細胞內容物釋出所引起的炎癥反應和伴有的組織細胞壞死。Annexin-V 是一種Ca2+依賴性的磷脂結合蛋白，與PS有高度親和力。因此該蛋白可以作為一種敏感的探針，用以檢測暴露在細胞膜外層的 PS，故適合凋亡細胞的檢測。由于壞死細胞失去膜的完整性，PS也會暴露，故必須區分凋亡細胞與壞死細胞。用一種PI染料做染色排斥實驗，就可以從Annexin-V染色陽性細胞群中區分出壞死的細胞。在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞無任何熒光標記；凋亡細胞膜上染有黃綠色光環；壞死細胞膜上染有黃綠色光環，胞核被PI染成紅色。 ? 【材料與試劑】 （1）Annexin-V-FLUOS Staining Kit（ 寶靈曼公司產品）： Annexin-V-Fluorescein （瓶1） Propidium iodide （瓶2） Binding Buffer （瓶3） 標記液的配制（用于10份試驗）：將20μl Annexin-V-Fluorescein（瓶1）溶于1000μl Binding Buffer（瓶3），然后加20μl PI（瓶2）。 （2）培養細胞或離體細胞制成的單個細胞懸液 （3）熒光顯微鏡 （4）PBS ? 【操作方法】 收集細胞，用PBS洗滌兩次，4000r/min離心2min，吸棄上清；； 細胞團塊重懸在100μl標記液中，室溫孵育10～15min，PBS洗二次； 熒光顯微鏡下觀察； ? 【結果判斷】 ??? 正常細胞無任何熒光標記；凋亡細胞膜上染有黃綠色光環；壞死細胞膜上染有黃綠色光環，胞核被PI染成紅色。