一、CaCl2 感受態細胞的制備的實驗步驟

1．前夜接種受體菌(DH5α或 DH10B)，挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜(約16小時)；

2．取1ml過夜培養物轉接于100ml LB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3小時(250-300rpm)；

3．將 0.1M CaCl2 溶液置于冰上預冷；

以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作

4．吸取 1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；

5．4℃下3000rpm冷凍離心5分鐘；

6．棄去上清，加入 100μl預冷0.1M CaCl2 溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰上放置20分鐘；

7．4℃下3000rpm冷凍離心5分鐘；

8．棄去上清，加入 100μl預冷0.1M CaCl2 溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

9．細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑(15% - 20%甘油)后超低溫冷凍貯存備用(－70℃)。 二、電轉化法制備大腸桿菌感受態細胞的實驗步驟

1．前夜接種受體菌(DH5α或 DH10B)，挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜；

2．取 2ml過夜培養物轉接于200ml LB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養至OD600 =0.6(約2.5-3小時)；

3．將菌液迅速置于冰上。

以下步驟務必在超凈工作臺和冰上操作

4．吸取 1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；

5．4℃下3000rpm冷凍離心5分鐘；

6．棄去上清，加入 1500μl冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

7．4℃下3000rpm冷凍離心5分鐘

8．棄去上清，加入 750μl冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

9．4℃下3000rpm冷凍離心5分鐘

10．加入 20μl冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

11．立即使用或迅速置于 -70℃超低溫保存。 三、影響感受態細胞轉化效率的因素及實際操作過程中應注意的事項

1．細菌的生長狀態：實驗中應密切注視細菌的生長狀態和密度，盡量使用對數生長期的細胞(一般通過檢測OD600 來控制。DH5α菌株 OD600 為 0.5 時細胞密度是 5 × 107 /ml)；

2．所有操作均應在無菌條件和冰上進行；

3．經 CaCl2 處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加， 24小時達到最高，之后轉化率再下降(這是由于總的活菌數隨時間延長而減少造成的)；

4．化合物及無機離子的影響：在 Ca2+ 的基礎上聯合其他二價金屬離子(如 Mn2+ 或 Co2+ )、 DMSO 或還原劑等物質處理細菌，可使轉化效率大大提高(100-1000 倍)；

5．所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率；

6．質粒的大小及構型的影響：用于轉化的應主要是超螺旋的 DNA ；

7．一定范圍內，轉化效率與外源 DNA 的濃度呈正比。