一、實驗原理

RNA 是基因表達的中間產物，存在于細胞質與核中。對RNA 進行操作在分子生物學中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA 是很多分子生物學實驗所必需的，如Northern 雜交、cDNA 合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決于RNA 的質量。由于細胞內的大部分RNA 是以核蛋白復合體的形式存在，所以在提取RNA 時要利用高濃度的蛋白質變性劑，迅速破壞細胞結構，使核蛋白與RNA 分離，釋放出RNA 。

再通過酚、氯仿等有機溶劑處理、離心，使RNA 與其他細胞組分分離，得到純化的總RNA 。在提取的過程中要抑制內源和外源的RNase 活性，保護RNA 分子不被降解。因此提取必須在無RNase 的環境中進行。可使用RNase 抑制劑，如DEPC 是RNase 的強抑制劑，常用來抑制外源RNase 活性。提取緩沖液中一般含SDS 、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質變性劑，也能抑制RNase 活性。并有助于除去非核酸成分。

本實驗介紹異硫氰酸胍法和TRIzol 法提取動物組織總RNA 并通過電泳 進行鑒定。

二、儀器和試劑

1. 儀器：

超凈工作臺、高速冷凍離心機、電泳儀、紫外分光光度計、凝膠成像系統、振蕩器、移液器、吸頭、Ep 管、玻璃勻漿器、試管、

玻璃器皿洗凈后置180 ℃烘烤8h ；不耐高溫的器皿（如塑料制品）應用0.1% DEPC 浸泡2h,70 ～80 ℃烘烤干燥，120 ℃高壓20min ，再70 ～80 ℃烘烤干燥方可使用。

2. 試劑：

(1) 細胞裂解液：

異硫氰酸胍 4mol/L

檸檬酸鈉（pH7.0 ） 25mmol/L

十二烷基肌氨酸鈉 0.5%

β- 巰基乙醇 0.1mol/L

稱取檸檬酸鈉0.64g ，十二烷基肌氨酸鈉0.415g ，吸取β- 巰基乙醇0.7ml ，用無Rnase 的蒸餾水溶解，定容至50ml 。然后取以上配制的溶液(CBS 液)33ml ，異硫氰酸胍 25g, 混合，完全溶解后4 ℃保存備用。

(2)10 ×凝膠緩沖液：

嗎啉代丙璜酸（MOPS ）（pH7.0 ） 200mmol/L

NaAc 100mmol/L

EDTA(pH 8.0) 10mmol/L

過濾除菌后避光保存。

（3 ）5 ×變性上樣緩沖液：

水飽和的溴酚藍 16 μl

500mmol/LEDTA(pH 8.0) 80 μl

甲醛（37% ） 720 μl

甘油 2ml

甲酰胺 3084 μl

10 ×凝膠緩沖液 4ml

加無RNase 水至10ml ，4 ℃可保存3 個月。

（4 ）TRIzol RNA 抽提試劑

（5 ）2mol 醋酸鈉

（6 ）0.1% DEPC

(7 ) 平衡酚：氯仿：異戊醇（25 ：24 ：1 ）

（8 ）平衡酚、氯仿

（9 ）無水乙醇、70% 乙醇、異丙醇

(10) 無RNase 水

三、操作步驟

（一）異硫氰酸胍法（PLT ）

1. 取新鮮動物組織0.1 ～0.2g 置于組織勻漿器中，加入預冷的細胞裂解液1ml, 在冰浴中迅速勻漿15 ～30s ，以充分研碎組織。然后將細胞懸浮液吸入另一試管中。

2. 加入2mol 醋酸鈉（pH4.0 ）120 μl ，充分混勻。

3. 加入1.2ml 酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s ，冰浴15min 。

4. 將混合物轉移至1.5ml Ep 管中，4 ℃，離心10 000r/min,20min.

5. 移取上層水相至另一Ep 管中，加入等體積的異丙醇，靜置?C20 ℃，30min 沉淀RNA.

6. 4℃ ，離心12 000r/min ，15min.

7. 棄上清液，加入70% 乙醇400 μl, 洗滌RNA 沉淀物；如果RNA 沉淀物被懸浮，則4 ℃離心10 000r/min ，10min 。

8. 棄上清液，自然干燥，但應避免沉淀完全干燥，否則RNA 難以溶解。

9. 加入100 μl 無RNase 水重懸RNA ，或加1ml 無水乙醇和1/10 體積3mol 醋酸鈉（pH4.0 ），?C70 ℃保存。

（二）TRIzol 試劑提取RNA

1. 取新鮮動物組織0.1 ～0.2g 置于組織勻漿器中，加入預冷的Trizol 液 1ml 于玻璃勻漿器中，在冰浴中迅速勻漿15 ～30s ，以充分研碎組織。然后將細胞懸浮液吸入另一1.5ml Ep 管中，于室溫下靜置5min 。

2. 加入200 μl 氯仿，劇烈振搖15s 混勻后，室溫靜置3min 。

3. 4℃ ，10 000r/min 離心15min ，RNA 分布于水相中。

4. 將上層無色水相轉移到另一Ep 管中，加入500 μl 異丙醇，室溫靜置10min 。

5.4 ℃，10 000r/min 離心10min 。

6. 棄上清液，用1ml 75% 乙醇洗滌RNA 沉淀物，4 ℃，7500r/min 離心5min 。

7. 棄上清液，室溫干燥15min.

8. 向干燥過的沉淀物中加入200 μl DEPC 處理水（無核水）溶解沉淀物，于-20 ℃保存備用。

（三）RNA 檢測

1. 在紫外分光光度計上檢測RNA 濃度及純度。

方法同實驗四，用DEPC 處理水校正零點；用DEPC 處理水稀釋RNA 樣品；讀取OD260 、OD280 值及OD260/OD280 的比值。

2. 瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳檢測

（1 ）制備凝膠（1.2% ）。稱1.2g 瓊脂糖，加72ml DEPC 處理水，加熱熔化。冷卻至60 ℃，在通風櫥內加入10 ×凝膠緩沖液10ml ，甲醛（37% ）18ml ，混勻后，倒膠。

（2 ）制備樣品。在離心管中，將RNA 樣品與5 ×變性上樣緩沖液以4 ：1 混勻。65 ℃溫育5 ～10min ，迅速在冰上冷卻5min ，離心數秒。

（3 ）上樣前凝膠須預電泳5min ，隨后將樣品卷入上樣孔。以5V/cm 的電壓電泳1.5 ～2h. 。

（4 ）待溴酚藍遷移至凝膠長度的2/3 ～4/5 處結束電泳。將凝膠置于溴化乙啶溶液（0.5 μg/ml ，用0.1mol/L 乙酸胺配制）中染色約30min 。

（5 ）在凝膠成像系統觀察并分析。

四、注意事項

1.RNA 是極易降解的核酸分子。因此提取總RNA 必須在無RNase 環境中，戴口罩、手套、使用無RNase 污染的試劑、材料、容器。

2. 所有溶液應加DEPC 至0.05% ～0.1% ，室溫處理過夜，然后高壓處理或加熱至70 ℃ 1 小時或60 ℃過夜，以除去石油殘留的DEPC 。

3. 所用的化學試劑應為新包裝，稱量時使用干烤處理的稱量勺，所有操作均應在冰浴中進行，低溫條件可減低RNA 酶活性。

4. 根據RNA 樣品的紫外吸收OD 值，可計算出RNAd 濃度。

單鏈RNA [ssRNA]=40 ×（OD260-OD310 ）×稀釋倍數

純RNA OD260 / OD280 比值通常在1.7 ～2.0 。若比值低于1.7, 說明有蛋白質等污染，應用酚/ 氯仿在抽提。若比值低于2.0, 表明有鹽、胍、糖可用LiCL 選擇沉淀RNA 以除去雜質。

5.RNA 樣品電泳后，可見28S 、18S 及5S 小分子RNA 條帶，則說明完整性好。若有降解可能是操作不當或污染了RNase. 。28S 和18S RNA 比值約為2 ：1, 表明RNA 無降解。如比值逆轉，則表明RNA 降解。電泳中如果在28S 后方還有條帶，表明有DNA 污染，應用DNase 處理后再進行純化。