RNA Markers的使用方法(適用于RNA Marker RL1,000、RL6,000、RL10,000）

RNA Marker ( RL1,000; RL6,000; RL10,000)

可以進行一般瓊脂糖凝膠電泳和變性瓊脂糖凝膠電泳。

以RL10,000為例，具體使用方法如下：

普通瓊脂糖凝膠電泳時

1.按下列組份配置RNA Marker樣品。

2.均勻混合后65℃加熱10分鐘，迅速冷卻至室溫（最好用PCR儀)。

3.使用高質量的瓊脂糖，用1×TAE Buffer制備3%凝膠*，制膠時凝膠中請加入溴乙錠(最終濃度：1 μg/ml)。

4.將上述操作2配制的Marker樣品加樣后，在1×TAE Buffer中電泳。* RL6,000; RL10,000使用3%凝膠，RL1,000需使用5%凝膠。

甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳時

1.按下列方法配制5×MOPS-EDTA Buffer（0.1 M MOPS pH7.0，5 mMEDTA, 10 mM CH3COONa)。

①稱量20.9 g MOPS置于1 L燒杯中。

②加入約700 ml的DEPC處理水，攪拌溶解。

③使用2 N NaOH調節pH值至7.0。

④向上述溶液中加入10 ml的1 M CH3COONa（DEPC處理水配制)。

⑤溶液中加入10 ml的0.5 M EDTA pH8.0（DEPC處理水配制)。

⑥DEPC處理水將上述溶液定容至1 L。

⑦使用0.45 μm濾膜過濾后室溫避光保存。

2.按下列組份配制RNA Marker樣品。

3.均勻混合后，70℃加熱5分鐘，迅速冷卻至室溫（最好用PCR儀)。

4.甲醛變性瓊脂糖凝膠配制如下*：制膠時加3 g高質量的瓊脂糖到93 mlDEPC水中，另加30 ml 5×MOPS-EDTA。煮沸直至完全溶解。加入DEPC水定容至123 ml。讓溶液冷卻至60℃左右后，加入27 ml 37%甲醛（在通風櫥中操作）倒膠后于室溫靜置1小時。

5.加樣前將膠在1×MOPS-EDTA中預電泳30分鐘。

6.混勻電泳槽中的1×MOPS-EDTA Buffer（電泳液)，加入上述操作2配制的RNA Marker 樣品后，10 V/cm（恒壓）條件下電泳1小時左右，此時應每隔30分鐘混勻電泳槽中的電泳液一次。

7.電泳結束后，將凝膠在DEPC處理水中浸泡15分鐘，除去凝膠中的甲醛。

8.使用DEPC處理水制備的EtBr（5 μg/ml）染色2 ～ 3分鐘。用DEPC處理水脫色30分鐘，再換水脫色30分鐘后成像觀察。如果背景偏高時可以進一步將凝膠脫色。* RL6,000; RL10,000使用3 g瓊脂糖膠粉，RL1,000使用6 g瓊脂糖膠粉。

注意：甲醛凝膠用EtBr染色較為困難，即使RNA樣品染上了明顯的條帶也會帶來較高的背景。因此，應控制凝膠在染色劑中的浸泡時間小于5分鐘，以降低背景。

Note使用注意

1.RNA極易分解，應嚴格防止核酸分解酶的混入。實驗操作時應帶手套，實驗的儀器及溶液應經DEPC處理。操作不嚴禁會造成RNA降解，導致RNA Marker中的條帶不清晰或不完整。

2.RNA Marker中的RNA為單鏈線性RNA，因此，當進行體外轉錄得到的RNA、或經提取得到的mRNA等單鏈線性RNA電泳時，可使用本制品作為分子量大小的參照標準,但對于Total RNA, 本Marker只能作為定性參照標準。

3.若脫色后觀察不到Marker的條帶，可能是由于膠被染上了較高的背景，此時可以進行反復脫色后再進行觀察。