關于設計siRNA以及siRNA設計對siRNA功能的影響，至今還沒有可靠的規律。雖然我們可以通過對mRNA實驗分析準確的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置，但這個過程十分耗時且昂貴，不推薦常規實驗使用。一種做法是每個目標序列設計3-4對siRNAs，實驗選擇較有效的siRNA。

方法一、根據Tuschl的實驗的設計要點

目前，siRNA設計大都根據Tuschl的實驗，要點如下：

1.目標基因開放閱讀框起始密碼下游75至100堿基位置開始，尋找“AA”二連序列后的19個堿基序列。（用非“AA”的“XY”序列后的19個堿基序列同樣可以得到很好效果的siRNA）。 設計siRNA時不要針對5' 和3' 端的非編碼區。

2.分析獲得的序列，選擇GC比在40-55%之間的靶基因序列作為優選。

3.將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。

4.如果您選擇shRNA，有報道顯示9個寡核苷酸的環是最有效的。

方法二：

1. 從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3' 端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為效。Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5' 和3' 端的非編碼區（untranslated regions，UTRs），原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。

2. 將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

3. 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

負對照

一個完整的siRNA實驗應該有負對照，作為負對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和其他基因沒有同源性。 如果計劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個堿基序列，廠家會合成一對互補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3'dTdT結尾，如果要UU結尾的話通常要特別說明。有結果顯示，UU結尾和dTdT結尾的siRNA在效果上沒有區別。因為這個突出端無需和靶序列互補。