感受態大腸桿菌制備方法

試劑 配制： A 液：1M，MnCl2；mol/L B 液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌； C 液： 稱取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部轉入細口 試劑 瓶，然后加入46ml 三蒸水（一級水），輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。 TB 緩沖液： 方法步驟： 1、溶液配制取1 管B 液（0.6ml），全部加入C 液(46ml)中，混勻后，再用1ml 移液器加入3.3ml A 液，混勻冰浴即可使用。 2、劃線得到單菌落37℃培養箱培養過夜（約17h）， 挑取2-4 個形態飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養基的三角瓶,37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養3-4 小時, 將培養溫度調至18℃劇烈振蕩（328 rpms）培養， 3、其余與普通感受態差不多，每管加入4ml TB 緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮， 4、加入280ml DMSO（可用國產分析純），混勻后分裝入1.5ml EP 管，冰上靜置15 分鐘。 5、用紗布將所有裝有感受態的EP 管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時以上 6、取出感受態放入-70℃超低溫冰箱備用。 效率非常高，一般可到10×8，好時可到10×9，特別適宜于大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。 潔凈是最重要的。無菌都無所謂，在操作臺上可正常操作。離心力要注意不要超過2500g,建議1500-2000g 5min。涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2 小時以上的板。涂完后建議空氣晾干（20-30 分鐘）這樣會減少衛星菌落出現。 預冷是必要的。整個過程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時經常在室溫倒置1min，對感受態效率提高有幫助，第一次多加一點緩沖液，我經常加至20ml，效果不錯。 關于大腸桿菌的感受態制備及轉化的方法很多，最復雜的莫過于電轉化，而最簡單的則是將LB 平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP 管冰箱即開始轉化。對于做克隆工作的人而言，高而穩定的感受態可減輕不少麻煩。 現在大腸桿菌轉化效率最高的要數電轉化，可達到1010，但是操作起來比較麻煩。要想又簡單，又能有較高的轉化效率，最好的莫過于1990 年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受態的制備與轉化方法。 根據實驗室的實際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP 文件，但其中仍有許多可改進或需要注意的地方，其中有一些對普通感受態效率的提高也有一定的幫助。 1、所用器具的潔凈程度。這一點非常重要，是所有與感受態有關的方法與文章上必講的，毋庸置疑。 2、培養基的裝量：培養基的裝量是很重要的，這關系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態的。建議裝量不要高于此值為：培養基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。 3、培養基的pH 值。這是講的pH 值并非單指配置或滅菌后的pH 值，而且還包括整個搖瓶結束后的pH 值。一般來說，接種前的pH 值在6.8-7.2，等菌搖好后，可以測一下pH 值，不要低于6.0，最好在6.5 以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好，按要求做，肯定效率不低。 4、培養后的OD 值。其實這并一個非常重要的參數，只是當OD 值大到一定的程度后，菌體要保持對數生長已經不太可能，因此很多指導方法上強調OD 不得大于0.6，0.8 等等。同時，OD值大時菌體總量大，因而感受態絕對數量要大一點，因而需要在OD 值的兩方面影響中找一個平衡點。 5、培養基中的各種離子。經驗證明，當培養基中存在一定量的Mg2+離子時，該方法制得的感受態要相對較高。在制備普通感受時，使用20mM MgCl2 做為培養基的添加物，在感受態收獲之前20-30 分鐘加入，會收到很好的效果。