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核糖核酸探針

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1． 室溫下，于 1.5ml 無菌微量離心管內依次加入：

5 μ l?????????????? 5 ×轉錄緩沖液

1 μ g?????????????? 模板 DNA

1.2 μ l???????????? 10 mmol/L rATP （終濃度為 480 μ mol/L ）

1.2 μ l???????????? 10 mmol/L rCTP （終濃度為 480 μ mol/L ）

1.2 μ l???????????? 10 mmol/L rGTP （終濃度為 480 μ mol/L ）

1 μ l?????????????? 1 mmol/L UTP （終濃度為 40 μ mol/L ）

1 μ l?????????????? 0.75 mol/L 二硫蘇糖醇

1 μ l?????????????? RNase Block Ⅱ或 0.5 μ l RNasin

5 μ l?????????????? α -[32 P]UTP （ 2.5 μ mol/L 終濃度， DEPC 水加至 25 μ l ）

1 μ l?????????????? T3, T7 或 SP6 RNA 聚合酶（ 10U ）

2． 37 ～ 40 ℃溫育 60min 。

3． 若不做凝膠純化步驟，則：

a.?????? 加入 1 μ l 無核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶并在 37 ℃溫育 15min 。

b.????? 加 DEPC 處理水將體積增至 100 μ l 。加 100 μ l 苯酚：氯仿：異戊醇（ 25 ： 24 ： 1 ）溶液再提取一次。

c.?????? 再加入 100 μ l 氯仿：異戊醇（ 24 ： 1 ）溶液再提取一次。

d.????? 加 0.5 倍體積 7.5mol/L 乙酸銨及 2 倍體積乙醇，置干冰中 30min 。

e.?????? 10 000 × g 離心至少 5 min （去除上清液并用蓋革計數器監控）。

f.??????? 用 100 μ l 1mol/L 乙酸銨重懸沉淀小團，重復 d ～ e 步驟。

g.?????? 真空（真空旋轉蒸發 / 濃縮儀）干燥沉淀小團，用 DEPC 水重懸沉淀小團，取 1 μ l 置液閃儀計數。

4． 若需做凝膠純化，則：

a.?????? 將無 RQ1 RNA 酶的 DNA 酶處理步驟省去。

b.????? 制備測序凝膠（ 5 ％聚丙烯酰胺 /6mol/L 尿素）

c.?????? 加 DEPC 水將核糖核酸探針溶液體積增加至 100 μ l ， 100 μ l 苯酚：氯仿：異戊醇（ 25 ： 24 ： 1 ）溶液提取一次， 100 μ l 氯仿：異戊醇（ 24 ： 1 ）再提取一次。

d.????? 加 0.5 倍體積 7.5mol/L 乙酸銨，加 2 倍體積乙醇置干冰 30 分鐘。

e.?????? 10 000 × g 離心至少 5min （去除上清液，并用蓋革計數儀監控），真空干燥，用 5 μ l DEPC 水重懸沉淀。

f.??????? 加 10 μ l 上樣緩沖液，全部的樣品上樣電泳（樣品上樣前加熱到 85 ℃ 5min 即置入冰中），在 60W 條件下至少電泳 1.5h 。

g.?????? 去除玻璃板，用塑料薄膜包裹凝膠， X 射線膠片曝光 30 ～ 60s ，核糖核酸探針所處位置呈現自顯影像，用剃須刀準確切下相應凝膠條帶。

h.?????? 凝膠條用 400 μ l 洗脫緩沖液， 37 ℃下，連續振蕩洗脫 4h 。洗脫液移入干凈離心管，蓋革計數器檢測洗脫液及凝膠條塊（洗脫液中計數值應高于凝膠條）。

i.???????? 加 1 μ l 冰冷乙醇并靜置冰浴 15min 。

j.??????? 10 000 × g 離心 15min ，乙醇沉淀。 RNA 沉淀用 DEPC 水再溶解，取 1 μ l 置液閃儀計數。

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