一、 目的 學習幾種小規模制備質粒DNA的技術，比較這幾種方法所制備的幾種質粒DNA的效果。 二、 原理 在介紹的載體中，有PUC系列、PBS與PBR322均屬拷貝數較高的質粒，只要用小規模制備一次的質粒DNA，就有足夠的量用于常規的基因工程操作。小規模制備質粒DNA的特點是可以一次制備多種質粒DNA(12—24個不同的質粒DNA樣品)，速度快，時間省，步驟簡化，DNA純度好，可以用于酶切、連接，甚至多純化幾次還可做雙鏈DNA序列分析的模板等常規基因工程操作之用。 其中堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分 離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。只是將溶液Ⅰ和溶液Ⅱ試劑和加入的比例做了修改，這種修改增加了質粒DNA在溶液中的粘度，減少了KAc的離子強度。這種方法對分子量稍大的質粒DNA更合適。 用各種不同孔徑的凝膠住層析，進行分離純化蛋白質、酶、核酸等生物樣品的技術。目前也常用DNA的微量過柱以達到純化DNA的目的。DNA的微量過柱常用Sephadex G50葡聚糖凝膠，做成約300微升凝膠的Eppendorf管小柱，對1～5微克的DNA樣品離心過濾20秒鐘，就能得到很高的純化效率。這種過柱的樣品可以直接進行DNA測序分析。 三、 材料 (一) 儀器 接種針 1ml移液管 1.5ml Eppendorf管 200ml吸頭 冰塊 牛皮紙 紗布蓋 線繩 (二)器皿 微量移液器 渦流混合器 低溫高速離心機 1.5mlEppendorf管 培養皿 (三)菌種 1. 大腸桿菌HB101 (pBR 322) 2. 大腸桿菌JM103 (pUCl8) 3. 大腸桿菌TGI (pBS SK + ) 4. 大腸桿菌C600 pXZ6